摘要：采用聚合酶链反应及基因工程技术，克隆卡介苗(BCG)的主要分泌抗原Ag85B基因的5’端第94～211的核苷酸的信号肽序列和构建重组人 IL-2 穿梭表达质粒，并用酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定外源基因在BCG中的表达。结果表明，构建的BCG重组体能表达和分泌人 IL-2。此将试用于临床治疗膀胱癌病人。

中图分类号：Q784文献标识码：A

文章编号：1007-3213(1999)01-0072-04

Construction of Recombinant Mycobacterium bovis BCG and Expression of

the Foreign Gene in BCG

ZENG Xing,YANG Ming,HUANG Yu,ZHANG Guo_lai

(Central Laboratory, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510120,China)

abstract:Polymerase chain reaction and genetic engineering technique were used to clone the signal peptide sequence (position:94 to 211) of antigen 85-B in Mycobacterium bovis BCG and construct the recombinant E.coli-mycobacteria shuttle plasmoid of human interleukin-2(IL-2).Expression of the foreign gene in BCG was detected by enzyme linked immunosorbent assay. The results suggest that the constructed recombinant BCG(rBCG) strain produce and secrete human IL-2 and it will be used for the treatment of superficial bladder cancer.

Key words:BCG VACCINE;SIGNAL PEPTIDES;INTERLEUKIN-2;BLADDER NEOPLASMS/therapy

卡介苗(BCG)是牛型分枝杆菌之减毒株，已广泛用于膀胱灌注预防膀胱癌术后复发及治疗浅表型膀胱癌。近年来卡介苗联合白介素2(IL-2)用作膀胱灌注，能增强免疫抗癌疗效，但 IL-2 存在半衰期短，用量大，毒性强的缺点。我们采用基因工程技术，合成一段BCG信号肽序列并在其下游连接人 IL-2 基因，再导入到BCG中，使BCG具有表达分泌人 IL-2 的能力。它将试用于临床治疗膀胱肿瘤。

1材料与方法

1.1材料

质粒pBluecript, PZ和 HSI2为本室收藏。BCG为上海生物制品所产品，限制性内切酶，T4连接酶，Taq酶，4XdNTP等及DNA测序试剂盒等购自华美公司，DNA合成试剂购自美国PE公司，Middlebrook 7H9培养基和ADC混合液购自美国DIFICO公司。

1.2仪器

基因脉冲仪购自美国Bio-rad公司，4800型DNA扩增仪及391型DNA合成仪购自美国PE公司，DNA测序仪购自Pharmacia公司。

1.3引物合成

正链引物：5’-GCC ATG AGC TCA CAG ACG TGA GCC GAA AGA TTC 核酸序列位置94～115；负链引物：5’-GCC GAA TTC CGC GCC CGC GGT TGC CGC TCCG核酸序列位置211～189。引物合成后的浓度根据D(260nm)(光密度，optical density,OD)值计算。

1.4卡介苗-抗原85-B基因信号肽序列的合成及测序

在PCR扩增缓冲体系中加入引物各 100 pmol，总体积 50 μL。扩增反应程序为：94℃ 预变性 5 min；94℃ 变性 1 min；60℃ 退火 1 min；72℃ 延伸 1 min；三温循环 30 次；最后 72℃ 延伸 5 min。将 PCR 扩增片断经限制性内切酶EcoRI和SacI消化后连接到质粒pBluecript的多克隆位点，提取质粒双链DNA，变性后作模板，采用Sanger^［1］的双脱氧链末端终止法进行DNA测序。

1.5质粒DNA的制备，纯化，酶切，片段回收，连接，转化及阳性菌落的筛选和鉴定

质粒 DNA 的分离按常规碱变性方法提取，不同质粒 DNA经相应限制性内切酶消化后，采用低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收目的 DNA 片段，经酚氯仿异戊醇纯化，乙醇沉淀，最后沉淀溶于适量 TE 溶液中，然后进行 DNA 的连接和大肠杆菌的转化，用含有氨苄青霉素或卡那霉素的LB 培养基筛选阳性菌落，并用酶切鉴定重组质粒。

1.6BCG培养，BCG感受态细胞的制备及转化

BCG菌种接种到综合苏通培养基(0.05%硫酸镁，0.2%枸橼酸，0.08%K₂HPO₄·3H₂O，0.8%味精，0.005%枸橼酸高铁铵，6%甘油)或用Middlebrook 7H9 培养基补加 ADC (葡萄糖、牛血清白蛋白及盐的混合液)和20%Tween 80，37℃静止培养。若加1 %～2%琼脂粉即为分支杆菌的固体培养基。分支杆菌感受态细胞的制备，参照 Cirillo 等的方法并有改进［Cirillo J D, Weisbrod T R,Jacobs W R.Efficient electro-transformation of mycobacterium smegmatis.Bio-Rad Laboratories(Guide)］。BCG在37℃培养至对数生长期［D(600 nm)≈0.5］，停止培养，冰浴1.5 h，离心(5 000 r/min，4 ℃)10 min，收集细菌，然后用10%甘油洗涤1次，再用预冷的甘油洗涤2次，最后沉淀溶于适量的甘油中，每管按200～400 μL分装，即制成BCG感受态细胞。然后取穿梭质粒DNA 1～5 μg加入到BCG感受态细胞中混匀。设未加质粒DNA组为阴性对照，置冰上 20 min，调整基因脉冲仪的参数，即电压2.5 kV，电流 25 mA，电阻 200 Ω，再将上述混合液转入电转化杯，按上述参数进行电穿孔转化，穿孔后马上加Middlebrook 7H9 培养基800 μL入电转化杯中混匀，再转入离心管 37 ℃ 200 r/min 2.5 h 培养，最后取 100 μL 涂布在含 50 mg/L 卡那霉素的分支杆菌固体培养基的平板上，37 ℃ 培养约4～5周，筛选转化子和鉴定，并用ELISA法^［2］测定重组BCG的培养上清中的表达产物。

2结果

2.1卡介苗抗原 85B(BCG-Ag85-B)信号肽序列的合成及鉴定

以BCG-Ag85-B基因上游的信号序列为依据，合成一对引物，用 BCG-DNA 作模板，在两引物之间扩增一特异性的 DNA 片段，其分子量是 117bp，将其片段先克隆到 pBluecript 质粒的 SacI 和 EcoRI 位点构建成重组质粒 BCG-SO1。然后采用 Sanger 的双脱氧链末端终止法对 BCG-SO1 克隆的BCG-Ag85-B 信号序列进行 DNA 序列分析，其中 CTTAAG 序列为 EcoRI的识别部位，也是信号肽与载体连接部位，该下游载体剩余12个多克隆位点，其序列与信号肽序列无同源结构，为 GCT TGG GGA CGC CGA TTG ATG ATC GGC ACG GCA GCG GCT GTA GTC CTT CCG GGC CTG GTG GGG CTT GCC GGC GGA GCG GCA ACC GCG GGC GCG CTT AAG CTA TAG TTC GAA TAG CTA TGG CAG CTG GAG CTC CCC CCC GGG CCA TGG ，故该重组克隆可提供携带外源基因的多克隆位点，可指导外源基因表达的外源蛋白分泌至胞外。

2.2重组人 IL-2穿梭表达质粒(PZSIII-I)的构建及鉴定

将含有 BCG-Ag85-B 信号肽序列的重组质粒 BCG-SO1 经用限制性内切酶 SacI 和EcoRI消化后收集较小的片段，同样用上述两种限制酶消化质粒PZ，获得一条单线性 DNA，经T4连接酶连接两片段后，再转化大肠杆菌和分支杆菌即构建成重组质粒(PZSIII)。再将人 IL-2 cDNA 从质粒 HSI2 中用限制酶 EcoRI和 BamHI 消化，克隆到 PZSIII 信号肽下游的EcoRI和BamHI位点，获得重组人 IL-2 穿梭表达质粒PZSIII-I。PZSIII和PZSIII-I经限制酶 EcoRI和SmaI酶切后分别获 5.0 kb 和 5.4 kb 的单一条带，用SmaI酶切后分别获两条带(见图1)。

图11%琼脂糖凝胶电泳图

1.λHindIIImarker; 2.PZSIII-I/SmaI；3.PZSIII/SmaI；

4.PZSIII/EcoRI；5.PZSIII-I/EcoRI；6.未酶切PZSIII-I

2.3重组质粒 PZSIII-I转化 BCG 和人IL-2在 BCG 中的表达

采用电穿孔方法，将PZSIII-I转化 BCG，转化后用含卡那霉素的固体分支杆菌培养基筛选阳性克隆，然后将阳性克隆进行扩大培养，用 ELISA 法测定阳性菌落培养上清液分泌的 IL-2，D(450 nm)=0.045，参照值为零。经SDS-PAGE鉴定，结果见图2。PZSIII-I转化受体菌总蛋白多一条“←”所指条带。

图2垂直板 SDS-PAG 电泳图

1、6蛋白分子量标准；2、4受体菌总蛋白质；

3质粒PZSIII转化受体菌后的总蛋白；

5重组质粒 PZSIII-I转化受体菌后的总蛋白

3讨论

随着人类基因技术的不断发展，肿瘤的生物学治疗作为手术、放疗及化疗之外的第四种治疗模式已取得了明显的进展。生物反应调节剂卡介苗、淋巴因子以及80年代末期兴起的肿瘤疫苗及DNA疫苗，这些治疗方法对抑制肿瘤生长，防止肿瘤的转移及改善宿主细胞的免疫力有一定疗效。特别是卡介苗用于治疗浅表型膀胱癌及防止术后膀胱肿瘤复发，已成为首选的治疗手段^［3］。已证实卡介苗抗肿瘤作用与刺激人体免疫系统有关，能刺激 T 细胞增殖，并转化成特异性细胞毒性 T 细胞，IL-2可增强卡介苗<