摘要：为探讨中药复方制剂通痹灵(以桂枝芍药知母汤为基础)对佐剂性关节炎大鼠(AA)滑膜细胞分泌白细胞介素 1(IL-1)、肿瘤坏死因子 α(TNF-α)和前列腺素 E₂(PGE₂)的影响，采用大鼠膝关节滑膜细胞原代培养的方法，检测脂多糖(LPS)诱导关节滑膜细胞培养上清中 IL-1、TNF-α 的活性和 PGE₂ 的含量。结果：AA 大鼠滑膜细胞培养上清中 IL-1、TNF-α 的活性和 PGE₂ 的含量高于正常组(P＜0.01)；通痹灵可使 AA 大鼠滑膜细胞异常升高的 IL-1、TNF-α 和 PGE₂ 分泌功能恢复正常(与 AA 组比 P＜0.01，与正常组比 P＜0.05)；甲氨喋呤(MTX)也在一定程度上下调了滑膜细胞的分泌功能(与 AA 组比 P＜0.01，与正常组比 P＜0.05)；消炎痛对 PGE₂ 的产生具有明显的抑制作用(与 AA 组比 P＜0.01，与正常组比 P＜0.01)，但进一步上调了 AA 大鼠滑膜细胞分泌 IL-1、TNF-α 的功能(与正常组比 P＜0.01)。结论：IL-1、TNF-α 和 PGE₂ 在类风湿性关节炎(RA)发病机理中占有重要地位；通痹灵对 RA 的治疗作用可能与其抑制滑膜细胞过度分泌细胞因子及炎症介质有关。

中图分类号：R593.22文献标识码：A

文章编号：1007-3213(1999)01-0017-04

Effect of Tongbiling on Synoviocytes Secretion of IL-1,TNF-α and PGE₂

in Rats with Adjuvant Arthritis

CHEN Ji-fan，ZHAO Hui-fang，SHEN Xiao-yan，LI Song-hua

LI Ying-min，LIAO Shi-huang，HUANG Yang-mo

(The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405,China)

abstract:To study the effects of Tongbiling (TBL) on synoviocytes secretion of IL-1,TNF-α and PGE₂ in rats with adjuvant arthritis (AA),IL-1,TNF-α bioactivity and PGE₂ content of supernatant culture of synoviocytes induced by lipopolysaccharides were assayed by the methods of primary cultures of rat synoviocytes.The results showed that the bioactivity of IL-1 and TNF-α and the content of PGE₂ of supernatant culture of synoviocytes from AA rats increased more obviously than those from normal control group. The abnormal function of synoviocytes from AA rats was restored tonormal after the treatment with TBL. Methotrexate decreased the secretion of IL-1,TNF-α and PGE₂ to some extent. Indomethacin inhibited the production of PGE₂ significantly while further promoted synoviocytes secretion of IL-1 and TNE-α.It is concluded that IL-1,TNF-α and PGE₂ play an important role in the pathogenesis of rheumatoid arthritis (RA) and the mechanism of TBL for RA is probably related to the inhibition of the over secretion of cytokines and inflammatory mediator by synoviocytes.

Key words:@ TONGBILING/pharmacol.;ARTHRITIS,RHEUMATOID/TCD ther.;

@TONGBILING/ther.use;GUIZHI SHAOYAO ZHIMU DECOCTION/pharmacol.;

ARTHRITIS,RHEUMATOID/TCD ther.;SYNOVIAL MEMBRANE/secretion;

INTERLEUKIN-1;TUMOR?NECROSIS?FACTOR;PROSTAGLANDINS

类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜慢性炎症、软骨吸收、骨质破坏和骨纤维化为特征的慢性自身免疫功能障碍性疾病。其关节损伤的病理过程与滑膜细胞、软骨细胞、巨噬细胞等产生的白细胞介素 1(IL-1)、肿瘤坏死因子 α(TNF-α)、白细胞介素 6(IL-6)等多种细胞因子密切相关^［1，2］。其中 IL-1、TNF-α 是关节软骨破坏的最重要的炎症介质，是 RA 发病机理中居中心地位的促炎症细胞因子^［3，4］。

中药复方制剂通痹灵是以经方桂枝芍药知母汤为基础研制而成。前文^［5～7］报道了通痹灵具有抗炎和免疫调节作用。本文采用佐剂性关节炎(AA)大鼠滑膜细胞原代培养的方法，观察通痹灵对滑膜细胞产生 IL-1、TNF-α 和前列腺素 E₂(PGE₂)的影响，进一步研究通痹灵抗 RA 的可能作用机理。

1材料与方法

1.1药品与试剂

通痹灵由本校第一附属医院制剂室生产，每片 0.25g；消炎痛(indomethacin,IM)，上海第十二制药厂产品；甲氨喋呤(methotrexate,MTX)，广州石歧制药厂产品；完全佛氏佐剂，日本三光株式会社产品；脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、刀豆球蛋白 A(ConA)以及放线菌素 D(actinomycin D)均为 Sigma 公司产品；溴化 3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基-2H-四氮唑［3-(4，5-dimethylthiazol-2-y1)2，5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide,MTT］，Fluka AG 产品；Ⅱ 型胶原酶(collagenase type Ⅱ，440U/mg)，Sigma 产品；胰蛋白酶(1∶250)，Difco 产品进口分装；上述二种试剂均用 D-Hank's 缓冲液配制；［³H］前列腺素 E₂(PGE₂)放免药盒，比放射性为 5.92 TBq/mol，中国医学科学院基础所药理室提供；RPMI 1640 培养粉与 DMEM(Dubecco's modified Eagle's medium)培养粉均为 Gibco 公司产品；应用液另加 25 mmol/L Hepes、1 mmol/L 丙酮酸钠、 2 mmol/L L-谷氨酰胺、 50 μmol/L 二巯基乙醇、 100 kU/L 青霉素、100 mg/L 链霉素和 10% 小牛血清，pH 调整至 7.20。

1.2动物及细胞株

清洁级 Sprague-Dawley 大鼠，♂，2～3 月龄，体重(180±20)g；C57BL/6，♀，4～6 周龄，体重(18±2)g，中山医科大学实验动物中心提供。L₉₂₉细胞株(小鼠纤维瘤细胞)购于第一军医大学附属珠江医院血液科，在含有 10%小牛血清的 RPMI 1640 培养液中传代培养。

1.3仪器

CO₂培养箱， HWO301T-VBA 型，美国 HARRIS 产品；离心机，LDZ4-OB 型，上海医用离心机厂；酶联免疫检测仪， 3550型，美国 BIO-RAD 产品。

1.4动物分组及模型复制

SD 大鼠 30 只随机分为通痹灵组、甲氨喋呤组、消炎痛组、空白模型组、正常组 5 组，每组用完全佛氏佐剂于每鼠右后肢足跖皮内注射 0.1mL (正常组免注射)复制 AA 模型。造模第 4 周开始灌胃，通痹灵组和消炎痛组分别按 5 g/(kg·d)、2 mg/(kg·d) 灌胃给药，甲氨喋呤组按 1.5 mg/(kg·w)灌胃给药。模型组和正常组按 10 mL/(kg·d) 用生理盐水灌胃。于实验第 16 周断头处死动物，分离关节滑膜。

1.5滑膜细胞的分离和培养

参照文献［8］，无菌条件下分离大鼠膝关节滑膜，用 D-Hank's 液冲洗 3 遍，剪成约 1～2 mm³ 小块，离心去除脂肪组织，经 0.2% 的胶原酶、 0.25%的 胰酶消化形成单个细胞，经 Giemsa 染色和台盼蓝染色，检测其纯度大于 98%、活力大于 95%，用含有 4 g/L LPS 的 DMEM 培养液配制滑膜细胞悬液 (5×10⁵)加入 24 孔平底培养板内，每孔 1 mL，置于 37℃、5%CO₂ 培养箱内培养 48 h，收集上清，离心 (1200 r/min,10 min) ，0.22μm 微孔滤膜过滤，-40℃ 保存待测 IL-1、TNF-α 活性。

1.6IL-1纯度、活性检测

1.6.1纯度检测采用活化的小鼠脾细胞检测^［9］。

1.6.2活性检测采用 C57BL/6 雌性小鼠胸腺细胞增殖法，参照文献［10］进行。用 10% RPMI1640 培养液将胸腺细胞数调至 1×10⁷ 个，将含亚适量 ConA (终浓度为 4 mg/L) 胸腺细胞混悬液和不同稀释度待测上清液各 100 μL 加到 96 孔平底培养板，并设空白对照(只含胸腺细胞)及 ConA 对照(ConA+胸腺细胞)。置5%、37℃ 培养箱中培养 66 h，加入 MTT(5g/L) 溶液 20 μL/孔，继续培养 6 h ，离心(2 000 r/min)10 min，弃上清，加二甲基亚砜溶液 150 μL，振荡 3 min，测 D 值(前称 OD 值，波长为 490 nm)，以 3 个复孔的 D 均值表示结果。

1.7TNF-α活性检测

采用L₉₂₉ 细胞杀伤法。参照文献［11］ 进行。计算杀伤百分率=［(1-实验组 D 值/对照组 D 值)］×100%。以 50% 杀伤率的最大稀释倍数为 1 kU/L。

1.8前列腺素 E₂(PGE₂) 的免疫测定

采用放射免疫法 (RTA) ^［12］。

1.9统计学处理

测定值以()表示，显著性检验用 t 检验。

2结果

2.1IL-1 纯度检测

ConA 活化的小鼠脾细胞对 ConA、LPS 及 IL-1 待测上清均不起增殖反应，而对<