摘要：从感染猴免疫缺陷病毒(SIV)的恒河猴血浆和培养细胞株中分别纯化病毒 RNA，经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SIV gag基因特异的 DNA 片段。将 RT-PCR 产物用地高辛标记，检测灵敏度比凝胶电泳和斑点杂交提高 100 倍。用已知拷贝数的 RNA 作为定量标准，可估计待测样本中 SIV RNA 的拷贝数。

中图分类号：R446.61文献标识码：A

文章编号：1007-3213(1999)01-0066-03

Quantitative Detection of Simian Immunodeficiency Virus RNA

by RT-PCR Combined with Digoxin Labeling

CHEN Zheng-tu，ZENG Qing-ping，FU Lin-chun

(Tropical Medicine Institute,Guangzhou University of TCM,Guangzhou 510405,China)

abstract:A simian immunodeficiency virus(SIV)gag gene-specific DNA fragment was amplified by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR)of RNA purified from the serum of SIV-infected marcaque monkey and a cultured cell line. The detection sensitivity of RT-PCR products by digoxin labeling was 100 folds as that by gel electrophoresis and dot blotting. The copy number of SIV RNA to be measured could be estimated by using a standard RNA whose copy number was known.

Key words:SIV/immunology;POLYMERASE CHAIN REACTION;

GENETIC MARKERS;DIGOXIN/diag.use

猴艾滋病模型^［1］是当今国际公认的评价艾滋病治疗药物与疫苗疗效及安全性的最佳实验动物模型，俗有“黄金标准”(gold standard) 之称^［2］。对用药后艾滋病模型猴外周血中猴免疫缺陷病毒(SIV) RNA 的定时、定量、动态监测是正确评价药物疗效的重要环节之一，也是目前国际上公认的病毒负荷检测指标。以往采用竞争性聚合酶链反应或逆转录—聚合酶链反应 (PCR/RT-PCR) 对 DNA/RNA 进行定量检测时，常因凝胶分辨力差或显示信号不足而导致检测灵敏度下降，有时还得出“假阴性”结果。为此，我们采用 RT-PCR 结合高效地高辛标记的双重放大技术检测 SIV RNA，检测灵敏度大幅度提高，重复性好，适合进行大样本中 SIV RNA 的定量测定，为今后开发高效、实用的 DNA/RNA 定量检测试剂盒打下了良好的基础。

1材料和方法

1.1SIV 核酸提取

感染 SIVmac251 的恒河猴血浆和感染 SIVmac 的CEMx174 细胞由本所吴小闲教授提供。采用德国宝灵曼公司病毒核酸提取试剂盒提取 SIV RNA/DNA，所用样本量为 200 μL，核酸提取产物定容为 50 μL。

1.2RT-PCR 扩增

SIV gag 上游引物为5’AATGAGGAGGCTGCAGATTGGGACTTG3’，下游引物为 5’GCACTATCTTG

CAATCTGGGTTAGC3’，由中国医学科学院实验动物研究所合成。扩增反应条件为 48 ℃，45 s，94 ℃，2 min，然后94 ℃，30 s，60 ℃，1 min，68 ℃，2 min，循环 40 次，最后 68 ℃，7min。所用标本量为 2 μL。标准 RNA 及其扩增引物均购自美国普罗麦格公司。采用英国 UVP GDS-760 凝胶联机成像系统检测扩增产物。

1.3地高辛标记与斑点杂交

采用德国宝灵曼公司的地高辛试剂盒及尼龙膜进行标记、杂交。

1.4探针纯化

按美国普罗麦格公司 PCR 产物纯化试剂盒说明书操作。

2结果

2.1凝胶电泳检测灵敏度

将标准 RNA 的RT-PCR 产物经倍比稀释后进行凝胶电泳，结果只在稀释 10 倍和 10² 倍时检出特异性扩增带(图1)。

图1RT-PCR 扩增产物稀释后电泳图谱

1.扩增产物原液；2.10倍稀释液；3.10²倍稀释液

结果表明，凝胶电泳检测 RT-PCR 产物的分辨力较低，即使采用先进的凝胶联机成像系统，也只能检测稀释 10² 倍的扩增产物。

2.2地高辛标记 RT-PCR 产物的显色灵敏度

在对 10⁶ 拷贝的标准 RNA 进行 RT-PCR 扩增后，经地高辛标记、稀释和显色，结果如图2所示。

图2地高辛标记扩增产物的检测灵敏度

1.标记产物原液；2.10倍稀释液；3.10²倍稀释液；

4.10³倍稀释液；5.10⁴倍稀释液

结果表明，RT-PCR 扩增后标记产物稀释 10⁴ 倍后仍能显色，检测灵敏度比凝胶电泳提高了 100 倍。根据起始拷贝数( 10⁶拷贝)推算，可检出的 RNA 为 10²拷贝。

将编号为 115 的猴血浆和感染 SIV 的 CEMx174 细胞的 RT-PCR 产物用地高辛标记，纯化后与标准 RNA 的 RT-PCR 标记产物共同显色，结果从细胞和血浆标本中分别可检出稀释 10³ 倍和 10⁴ 倍的 SIV RNA (图3)。

图3地高辛标记扩增产物的定量

A.细胞样本；B.血浆样本；C.标准；1.原液；2.10倍稀释液；3.10²倍稀释液；

4.10³倍稀释液；5.10⁴倍稀释液

以最低检测阈值为 10²拷贝计算，可反推出细胞和血浆标本中所含 SIV RNA 分别为 10^5 拷贝 和10⁶ 拷贝。按浓缩比为 250 计算，两样本实际 SIV RNA 浓度分别为 2.5×10⁷/ mL和 2.5×10⁸/ mL。

2.3RT-PCR 产物的斑点杂交

用地高辛标记的来自 CEMx174 细胞的 RT-PCR 产物作探针，分别与上述血浆和细胞来源的经过倍比稀释的 RT-PCR 产物杂交，结果如图 4 所示。

图4RT-PCR 扩增产物的斑点杂交

A.标准；B.血浆样本；C.细胞样本；1.10⁶拷贝；

2.10⁵拷贝；3.10⁴拷贝；4.10³拷贝；5.10²拷贝

由图 4 可见，在 10² 稀释倍数以下杂交呈阳性，而在 10³ 倍以上则呈阴性。由起始拷贝数可知，杂交只能检测到 10⁴ 拷贝以上的 RNA。

3讨论

血浆病毒 RNA水平是检测体内病毒负荷的常用手段，也是评价药物疗效的重要之一。然而，常用的核酸定量技术PCR/RT-PCR 一般采用凝胶电泳检测其扩增产物，当起始 RNA 以及随后的扩增产物浓度较低时，可能会因为凝胶电泳的分辨力差而出现漏检(假阴性)。因此，无论是采用凝胶成像系统检测还是电泳后进行目测比较，检测结果的分析都会受到凝胶分辨力的限制。为了有效地提高检测水平，我们将 RT-PCR 产物用“高效引导”(high-prime) 地高辛标记和显色系统加以检测，结果在RT-PCR 产物稀释 10⁴ 倍后仍能显色，使检出 RNA 的灵敏度从 10⁴ 拷贝提高到 10² 拷贝，提高幅度高达 100 倍左右，接近质控定量 PCR (QC-PCR) 的检测水平 ^［3］。

用已知拷贝数的 RNA 作为参比标准，通过平行的 RT-PCR 扩增和扩增后标记及显色，即可估计待测样本中的 RNA 拷贝数。这一研究结果为进一步开发灵敏有效和经济实用的 PCR/RT-PCR 定量检测试剂盒奠定了良好的基础。

另外 ，地高辛标记比同位素标记需时更短，操作更简单和更安全，二者的检测灵敏度相近，故地高辛的应用已经越来越广泛。

鉴于斑点杂交的检测水平与凝胶电泳相当，故 RT-PCR 产物的定量不必采用操作较为复杂的分子杂交法。但是，在定量测定前先采用杂交法排除假阳性，将能确保定量测定结果的可靠性。

基金项目：国家自然科学基金资助课题(39870725)和广东省自然科学基金资助课题(980642)

作者简介：陈征途，女，实验师；

参考文献：

［1］卢耀增，吴小闲，涂新明，等.猴免疫缺陷病毒(SIV)猴模型的建立［J］.中国实验动<