随着科学技术的进步和国内外在新药研制开发中越来越激烈的竞争和挑战，新药研究的重点逐步转向传统中药及天然产物的开发和利用。将先进的分子生物学技术与传统中药的研究结合起来，是中药研究现代化的重要手段。DNA分子诊断技术(DNA-Based Diagnostic Technigues)是一种重要的分子生物学技术，本文从几个方面综述其在中药研究中的应用。

1DNA分子诊断技术

DNA分子诊断技术也称DNA分子标记技术，是指通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律的技术。任何生物种或个体都具有特定的DNA多态性，通过直接诊断分析DNA的多态性，便能避开遗传性表现过程中的环境因素、数量性状遗传或部分与完全显性的干扰，快速准确地测定DNA的差异性^〔1〕。

DNA分子诊断技术已有10多种。目前广泛应用于中药研究的有下面几种：限制性内切酶酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphis. RFLP)技术、随机扩增多态性DNA(Random Amplifed Polymorphic DNA.RAPD)技术、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphic)技术、PCR-RFLP(PCR扩增的特定片段的限制性位点分析)技术和任意引物(AP-PCR)技术。

2DNA分子诊断技术在中药材的品种整理和鉴定中的应用

2.1基原的鉴定中药的基原鉴定是中药研究的基础和关键。现代分子生物学研究发现，中药材(不含矿物药)所依赖的生物资源“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性可在DNA分子诊断技术水平上检测。这比在形态、组织和化学水平上检测更能代表其变异类型的遗传标记。

山崎真已等^〔2〕报告采用RAPD和RFLP 两种分子标记分析了4种甘草属植物光果甘草(Glycyrrhiza glabra)、甘草(G.uralensis)、刺甘草(G.ech inata)和刺果甘草(G.pallidiflora)的遗传关系，结果发现富含甘草甜素的品种光果甘草和甘草之间遗传关系相近，这两者与含甘草甜素或含量极低的刺甘草和刺果甘草的遗传关系则较远，与植物分类学上的基原鉴定相吻合。进一步对4种商品甘草包括新疆甘草、西伯利亚甘草和阿富汗甘草采用RAPD技术作遗传距离估算以进行药材基原鉴别，初步证实阿富汗甘草来源于光果甘草，西伯利亚甘草来源于甘草，新疆甘草和西北甘草来源于胀果甘草；同时认为它们之间遗传距离不完全为零，可能与其他地理环境或存在亚种、变种有关^〔3〕。采用RAPD技术，山崎等成功地鉴别了日本当归药材基原。陈林姣等^〔4〕有效地鉴别了溪黄草类原植物。Kohjyouma等^〔5〕对日本和中国野生或栽培的白术、苍术类药材进行分析，发现日本栽培的茅苍术与中国产的RAPD指纹几乎一致。虽然存在含较高苍术酮的茅苍术，但未显示出茅苍术与白术或关苍术的杂交谱带。这表明茅苍术存在种内变异。

2.2种的鉴别中药种间的鉴别是关系中药材质量的一个因素。同科同属不同种或品种、亚种、变种之间的鉴别，采用DNA分子诊断技术可以达到可信度很高的结果。Nakai等^〔6〕采用RAPD和PCR-RFLP方法对淫羊藿属(Epimedium)8种植物进行了DNA分析。结果发现RAPD指纹较易区别箭叶淫羊藿(E.sagittatum)和其他7种淫羊藿。邵鹏柱等^〔7〕用AP-PCR指纹技术成功地鉴定出商品人参和西洋参。采用RAPD技术，对铁线莲属7种生药进行了鉴别，结果表明RAPD指纹图谱中种间差异明显而同种不同产地差异不明显^〔8〕；另有人对木蓝属8种生药进行了鉴别研究，结果满意^〔9〕。山崎真已等^〔10〕采用RFLP诊断技术成功地鉴定羽扇豆属的5种药用植物。采用AP-PCR诊断技术鉴别中国川芎(Ligusticum chu oanxiong Hort.)和日本川芎(Cnidium officinale Makino)，对黄芪属26个种及沙参属10个种进行鉴别，均获成功^{〔11～13〕}。此外，陈毓亨等^〔14〕用PAPD技术对温郁金(Curcrma Wenyujin)和川郁金(C.sichuanensis)进行种的鉴定，结果认为二者亲缘关系很近，聚合结果表明难以从DNA水平上把二者划分为2个种，而应合并为一个种，学名定为C.wenyujin。所以通过对种的DNA指纹诊断，既可区别不同的种，又可以对本草沿革中定名研究提出新的思路。

2.3中药真伪鉴定我国中药材许多品种来源复杂，互混、互代现象屡有可见。近年来，由于少数人受经济利益的驱使，药材伪、混品种的数量有增加的趋势。为确保中药使用安全、有效，对各种药材进行准确地鉴定显得十分重要。传统的经典鉴定中药的方法，对于某些品种，特别是动物药材或经过多道工序加工后的药材就显得力不从心。可是现代的DNA指纹诊断技术既可以鉴定一般经典方法能鉴定的药材，又可以克服经典方法的局限性。

蛇类药材乌梢蛇(Zaocys dhumades)和金钱白花蛇(Bungarus multicinctus)市场上出现6种混淆品和伪品，仅靠其外部形态和骨骼、鳞片特征难以鉴别。王义权等^〔15〕成功地利用PAPD技术准确地检出乌梢蛇和金钱白花蛇的混淆品和伪品。利用PCR技术成功地鉴定的药材还有很多，如对龟板和鳖甲的真伪鉴定^〔16〕，鸡内金的混淆品鸭内金的鉴定^〔17〕以及对紫河车以及鹿鞭的真伪鉴定等。

采用RAPD技术可鉴定蒲公英及其混淆品土公英^〔18〕、人参及其伪品^〔19〕、细辛及其伪品^〔20〕。

此外，还有人采用AP-PCR技术和RAPD技术鉴别了苦地胆及其混淆品白花地胆草和假地胆草^{〔21，22〕}。

2.4品质的鉴定

2.4.1道地和非道地药材的鉴别药材道地性研究已经成为中医药科研的重要课题。道地药材有一个地域性现象，其产生除了与栽培方法、生态环境、加工方法有关外，还与物种的居群的遗传特异性有关。这可能是造成道地药材与非道地药材的品质差异的原因。由于道地与非道地药材在形态和生药上基本一致，因此，利用DNA分子诊断技术水平鉴定二者，使道地药材的研究提高到分子水平，达到更为客观准确的目的。《日本药局方》收载的三岛柴胡(Bupleurum falcatum)是以日本九州为主要栽培地，但其具有多样性的地理品种。日本学者曾用RFLP分析，结果发现秋吉台、平尾台、香春、汤布院为代表的山口*北九州地理品系的RFLP与其他品系明显不同，这与形态学、细胞学、化学的研究结果相吻合^〔23〕。

2.4.2纯度的鉴定用DNA分子诊断技术，采用同一样本(或个体)多点取样的方法，就可排除药材掺伪带来的误差。如果每个部位所提DNA序列均一致并与对照序列吻合，则药材是正品并且没有掺伪。反之，如果其中一个部位的序列与对照序列不一致，则样品掺伪^〔24〕。在这方面的实例还未见报道。

在中药品质整理方面，除上述应用范围外，还有用于出土中药标本鉴定的报道^〔25〕。

3DNA分子诊断技术在中药复方制剂中的应用

中药复方是中医辨证理论精髓的集中表现，方剂的临床配伍有着深刻的科学内涵。在中药复方质量研究中，由于复方制剂成分复杂，许多动植物类中药成分目前尚不明确，其质量标准难以制定。而且在中药复方制剂中，某些药是否存在，用传统的鉴别方法有时难以奏效。但用PCR技术对复方中黄连建立了DNA分子定量分析标准^〔26〕。此外有报道用RAPD技术可以鉴定某些人参制剂中的药材品种^〔27〕。

尽管DNA分子诊断技术出现的时间不长。但其在中药研究过程中已显示出广泛的应用前景，相信其将对中药各方面研究的现代化起到更为重要的作用。

参考文献：

［1］王康正，高文远，范磊，等.DNA分子诊断技术在药用植物研究上的应用.中国中药杂志，1997，22(12)：707～709.

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［3］Yamazaki M,Sato A,Shimomura K,et al.Extraction of DNA and RAPD analysis from dried licorice root.Natural Med,1995,49:488.

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