摘要：目的：研究中药复方龙力胶囊对人肝癌HCC-9204的诱导分化作用及其机理。方法：用体外培养方法培养HCC-9204细胞，观察龙力胶囊对HCC-9204细胞形态学、集落形成能力、AFP与ALB分泌量、γ-GT活力、核型、细胞周期以及癌基因表达的影响。结果：龙力胶囊能改善HCC-9204细胞的异型性，降低其集落形成能力，降低AFP分泌量及γ-GT活力，提高ALB分泌量，降低细胞染色体主流范围，降低c-myc、c-H-ras基因表达，但对细胞周期影响不大。结论：龙力胶囊具有诱导HCC-9204细胞分化的作用，其机理可能涉及核型良性变及c-myc、c-H-ras降调节。

中图分类号：R735.7;R979.1文献标识码：A文章编号：1004-0668(2000)01-0046-03

The Study of Chinese Medicine Compound/DPC Induced Differentiation

on Human Heptocarcinoma Cell Lines HCC-9204 and It's Mechanism

HU Bing, AN Hong-mei, LI Xin-min (胡兵,等)

The First people Hospital of Chenzhou (Chenzhou，423000，China)

ABSTRACT:Objective： To investigate the effects and meachanism of Chinese medicine compound/dragon power capsule (DPC) induced differentiation on human hepatocarcinoma cell lines Hcc-9240. Methods: The present study was carried out by using technique of cell culture in vitro. The effect was observed by monitoring cytomorphology, cloney-forming, the secretion of AFP and ALB,γ-GT activity,chromosome，cell cycle and expression of oncogene. Results:Morphology of HCC-9204 became well-differentiated, growth became slower, cloney-forming was inhibited, the secretion of AFP and γ-GT activity were reduced, the secretion of ALB increased and expression of c-myc. C-H-ras oncogene decreased, the main range of chromosome reduced, but cell cycle did not change markedly. Conclusions: DPC had the effect of induced differentiation on HCC-9204, the mechanism might be related to chromosome and Down Regulation of c-myc. c-H-ras oncogene.

KEY WORDS: Human hepatocarcinoma cell line; induced differentiation; nucleus mechanism; Chinese medicine compound/DPC

原发性肝癌（以下简称肝癌）一直是肿瘤治疗的堡垒，小肝癌的发现及其手术切除使得肝癌5年生存率一度得以提高^［1］，但与其他实体瘤相比仍处于很低水平，尤其是中晚期无法手术者仍不能得到有效的控制。为此，肿瘤学界正积极探索新的治疗模式，其中之一就是诱导分化治疗。1992年陈惠黎等首次将维甲酸用于肝癌的诱导分化治疗，有效率达30.3%，56%的患者可获病情稳定^［2］，但其毒副作用限制了其临床使用。比较而言，中药具有较少的副作用而且成本低廉，然而目前尚未见到中药复方的相关研究。龙力胶囊（Dragon Power Capsule，DPC）是陕西中医学院李新民教授的临床验方，由苦参、青蒿、鳖甲、丹参等组成，主要用于肝癌的治疗，临床观察取得了较好的成效，既往研究表明其具有多种抗癌活性，并可能具有诱导分化作用。为此，我们选用人肝癌细胞株HCC-9204^［3］对其诱导分化作用作了进一步的研究。

1材料与方法

1.1中药原液按原方比例配方，水煎，离心沉淀，除菌，密封，4℃保存。临用前RPMI₁₆₄₀完全培养液稀释成所需浓度。

1.2剂量筛选改良文献方法^［4］，HCC-9204细胞以1×10⁵/mL接种于96孔培养板，贴壁后以不同浓度梯度中药作用细胞，0.4%胎盘蓝染色，逐日镜下观察细胞变性、坏死及生长抑制情况。选择未出现毒性反应的最大剂量与生长抑制最低有效浓度按等比原则设置大中小3个剂量组，加空白对照组共4组，剂量分别为900 μg/mL、300 μg/mL、100 μg/mL、0 μg/mL（培养液终浓度，相当于生药量），D₁、 D₂、D₃、D₄ 表示。

1.3细胞培养与收获HCC-9204细胞在含10%胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所产品）RPMI₁₆₄₀(GIBCO产品）中贴壁生长，视生长情况2～3天传代1次。生化实验各组100 mL瓶接种贴壁后加中药，每2天更换、收集培养1次，用于AFP、ALB（白蛋白）检测。细胞常规计数后 PBS洗涤，离心沉淀-20℃保存，用于γ-GT检测。

1.4集落形成实验常规消化细胞调整浓度，直径30 mm培养皿接种1000个细胞，贴壁后加中药，作用4天后更换新鲜培养液，继续培养1周，肉眼计数每皿集落数，计算集落形成抑制率(＝(对照组集落数—实验组集落数)/对照组集落数)。

1.5细胞爬片制备按第四军医大学口腔医学院经验方法进行，直径90mm 培养皿内置载玻片，其上接种0.5×10⁴ /mL细胞悬液3～4点，贴壁后加适量含中药完全培养液，4天后弃培养液，PBS洗涤，95%乙醇固定，室温晾干保存备用。

1.6细胞匀浆制备与γ-GT检测收获细胞悬于pH7.4，0.05M Tris-Hcl缓冲液中，超声粉碎制备细胞匀浆，重氮试剂法检测γ-GT活力，结果换算成mIU/10⁶ cells。1mIU活力定义为在本实验体系中，1分钟γ-GT转化底物γ-L谷氨酰-α-萘胺生成1 μmolα-萘胺的能力。

1.7AFP与ALB检测收集培养液放射免疫法进行检测，操作按放免试剂盒（试剂盒购自中国原子能研究院同位素研究所）说明进行，结果算成ng/10⁷cells。

1.8染色体标本制备与G显带25 mL瓶接种培养，中药处理,视培养细胞中期分裂相居多时（约2～3天），加秋水仙素（华美公司产品）（终浓度0.2 μg/ mL），2 h后弃培养液，自制橡皮刮下细胞，0.075M Kcl低渗30 min，甲醇冰醋酸反复固定3次，最后一次过夜，90℃气干，胰酶（Sigma产品）显带，Giemsa染色，镜下计数，分析染色体。

1.9细胞周期检测25 mL瓶接种培养，中药处理，收获培养第3 天细胞，消化离心，PBS洗涤，调细胞浓度1×10⁶/ mL以上，乙醇固定（终浓度70%），1%Trition-100、0.01RNA酶及0.005%PI处理后，流式细胞仪(Coutter产品)检测，DNA multicycle软件分析，计算各时相细胞百分比。

1.10癌基因表达检测ABC法进行，细胞爬片0.25% Trition-100温育15 min，PBS洗涤，10%H₂O₂温育10 min，PBS洗涤，c-myc、c-H-ras 单克隆-抗(Oncogene Science产品)（1：200）温育4 h，PBS洗涤，生物素化二抗作用30 min，PBS洗涤，ABC复合物作用30 min，PBS洗涤，0.04%DAB-H2O2显色，苏木素复染，镜下观察。

1.11细胞形态学观察逐日镜下观察各组细胞生长情况及形态。爬片经苏木素-伊红染色，梯度酒精脱水，透明封片，镜下观察。

1.12数据处理数据以±s表示，符合方差齐性，正态分布数据作方差分析，q检验；偏态分布数据作H检验；计数资料作χ²检验。

2结果

2.1细胞形态学细胞经药物作用后，铺满瓶底速度变缓，部分恢复接触抑制，由对照组的成片成堆生长变为单个或分布稀疏，随药物浓度加大，细胞异型性（atypia）不同程度降低，由长梭型变为多边形、圆形或类圆形，核浓缩而深染。

2.2集落形成实验各组均有集落形成，随药物浓度加大，集落形成数明显降低(P＜0.05)，集落细胞数明显减少，大中小3 组集落抑制率分别为50.93%、29.9% 和19.08%。见图1。

图一 集落 形成实验结果

注：口集落数（X）I标准差（S）

n=3（下同）

2.3γ-GT活力空白组γ-GT活力始终维持在较高水平，呈一定的波动变化，第3天轻度上升，说明细胞从接种到生长稳定尚有一适应过程。各实验组持续下降，第5天最显著，此时细胞正从对数生长期进入缓慢生长期，这种变化可能与细胞生长状态有关。各组差异显著(P＜0.05)。见图2。

图二DPC对细胞-GT活力影响

—●—注D₂组 —△—D₂组

—×—D₃组 —○—D₄组

2.4AFP分泌量各组AFP分泌量均呈波形变化，培养第1天处于较低水平，提示细胞在贴壁过程中较少分泌AFP。第3天达高峰，第5天跌落，第7天略回升，这可能与细胞接种到贴壁，对数生长到缓慢生长过程细胞周期分布不同有关。药物作用后