摘要：Sprague-Dawley大鼠预免疫2周后，采用由腹腔逐渐过渡至静脉的方法，每日注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)。结果：静脉注射C-BSA2周后，荧光显微镜观察显示IgG沿肾小球毛细血管壁呈颗粒状沉积，光镜下可见有新月体形成，电镜下可见大量上皮下电子致密沉积物；4周后，上皮下电子致密沉积物融合成大片状；6周后，较多大鼠出现肾小球硬化。

A Rat Model of Membranous Glomerulonephritis With the Formation of Crescent and Glomerular Sclerosis

Wu Baoyu(武宝玉),Wei Min(魏民),Li Boguang(李伯光),et al.

(Department of Internal Medicine, Beijing TongRen Hospital, Beijing 100730,

Department of Pathology, Beijing University of Traditional Chinese Medicine, B eijing 100029)

ABSTRACT: After two-week preimmunization, Sprague-Dawley rat s were daily i njected with cationized bovine serum albumin (C-BSA) intraperitoneally. It was f ound that, after two-week C-BSA intravenous injection, granular deposits of IgG along glomerular capillary walls was shown by fluorescence microscopy, the forma tion of crescent shown by light microscopy and a large amount of subepithelial e lectron-dense deposits shown by electron microscopy; after four weeks, subepithe lial electron-dense de posits fused into large patches; after six weeks, glomerular sclerosis was found in most rats.

KEY WORDS: Membranous glomerulonephritis; Crescent; Glomerular scl erosis; Rat

用阳离子化抗原复制的膜性肾小球肾炎动物模型，其免疫发病机理和人类肾小球肾炎非常近似，是一种较理想的慢性肾小球肾炎病理模型^［1～3］。牛血清白蛋白是研究血清病最常用的抗原，然而用阳离子化牛血清白蛋白(Cationizedbovineserumalbumin,C-BSA)复制大鼠慢性血清病性肾炎的报道并不多，而且极少有新月体形成和肾小球硬化。本研究以大鼠为实验动物，用C-BSA复制慢性血清病模型，并使其产生膜性肾炎病变。

1材料与方法

1.1抗原制备

天然牛血清白蛋白：电泳纯，等电点为4.5，上海医学化学检验所产品。碳化二亚胺(EDC)：德国Merck公司产品。无水乙二胺(EDA)：分析纯，日本进口分装。参照有关文献［4］，在适宜的反应条件(pH4.75，T：25℃)下，用EDC活化蛋白的羧基，使之为EDA的胺基所置换，提高蛋白的等电点，使之大于9.0，制备出阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)。

1.2模型制作

实验动物为健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重160～200g，北京医科大学动物室提供。适应性喂养1周后，随机分为2组：病理组30只，用C-BSA复制肾炎模型；正常对照组15只，正常饲养，不作任何处理。

预免疫(致敏免疫)：用C-BSA1mg加弗氏完全佐剂0.5mL作皮下、肌肉多点注射，10d后重复免疫1次。预免疫2周后，每日注射C-BSA。先腹腔注射1周，第1日至第7日的剂量依次为2mg、4mg、6mg、8mg、10mg、12mg、14mg，之后改为尾静脉注射，共6周。尾静脉注射第1周第1天至第7天的剂量依次为1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg，此后每天8mg，直至实验结束。

1.3观察项目

1.3.1肾功能检查：①尿蛋白测定。定性：采用硫柳酸法，于注射C-BSA后隔日检测1次。定量：采用比浊法，于注射C-BSA后每周测定1次24h尿蛋白含量。②血清肌酐测定。于静脉注射C-BSA2、4、6周后，2组大鼠分别心脏取血，采用自动生化分析仪(HITACHI7150)测定。

1.3.2形态学观察：两组大鼠于静脉注射C-BSA2、4、6周后杀检取肾皮质，分别进行如下观察：①荧光显微镜观察：杀检大鼠取肾皮质，即刻恒温冷冻切片，制成5μm的切片，进行免疫荧光染色，采用直接法，荧光抗体为异硫氰酸荧光素标记兔抗大鼠IgG抗体(军事医学科学院微生物流行病研究所提供)。②光镜观察：取肾皮质，20%甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，制成3μm切片，分别进行HE、PAM-HE、PAM-Masson及PTAH染色，作光镜观察。③透射电镜观察：取肾皮质，2.5%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，Epon618包埋，超薄切片，1%醋酸铀染色，进行透射电镜(HITACHI-H600)观察。

2结果

2.1肾功能检查

2.1.1尿蛋白测定：静脉注射C-BSA1周后，病理组大部分大鼠出现蛋白尿，至第2周末，所有大鼠均出现较明显的蛋白尿，并于第3周末达高峰。正常对照组大鼠无明显蛋白尿。结果见表1。

表124h尿蛋白定量结果(mg;±s；n=10)

组别 第2周 第3周 第4周 第5周 第6周 病理组

124.17±30.15^***

230.82±17.02^***

221.04±38.81^***

213.75±60.14^***

188.64±58.88^*** 对照组 20.16±5.82 19.44±8.12 22.05±6.74 25.36±10.10 21.68±7.84

注：与对照组同期比较***P＜0.0012.1.2血清肌酐测定：静脉注射C-BSA4周后，病理组血清肌酐升高，第4、6周时与正常对照组比较，差异显著。结果见表2。

表2血清肌酐测定结果(μMol/L;±s；n=5)

组别 第2周 第4周 第6周 病理组

35.36±9.7211

60.99±10.61^*

90.17±15.91** 对照组 38.89±4.42 40.67±11.49 38.01±7.96

注：与对照组比较*P＜0.05**P＜0.01

2.2形态学观察

2.2.1荧光显微镜观察：静脉注射C-BSA2周后，病理组全部鼠肾标本均可见IgG沿肾小球毛细血管壁呈颗粒状沉积(照片1)。此后，沉积之IgG渐成粗颗粒状。

照片1静脉注射C-BSA2周后，IgG沿肾小球毛细血管壁呈颗粒状沉积。

抗大鼠IgG×200

2.2.2光镜观察：静脉注射C-BSA2周后，病理组大鼠肾小球毛细血管壁均为一致性增厚，有多量钉突(spike)形成，并可见上皮下免疫沉积物(PAM-Masson染色)，半数动物肾球囊内有蛋白渗出，部分动物有纤维素渗出，肾小球血管袢节段性坏死，可见新月体形成(照片2)。

照片2静脉注射C-BSA2周后，新月体形成，肾小球周围纤维化。

PAM-HE×400

4周后，部分动物出现肾小球节段性硬化或整个肾小球硬化，至第6周时，4/6例(66.7%)动物出现肾小球硬化(照片3)，硬化的肾小球占肾小球总数的28.5%(每张切随机计数20个肾小球)，并可见硬化的肾小球与代偿肥大的肾小球并存。

照片3静脉注射C-BSA6周后，肾小球硬化，肾小球周围纤维化。

PAM-HE×400

2.2.3电镜观察：静脉注射C-BSA2周后，病理组大鼠可见大量上皮下电子致密沉积物。4周后，沉积物融合成大片状(照片4)。

照片4静脉注射C-BSA4周后，上皮下电子致密沉积物融合成大片状。

透射电镜×8000

3讨论

Arisz等^［5］指出，用异种蛋白(如BSA)给致敏大鼠静脉注射复制血清病性肾炎时，超敏反应致大鼠高死亡率是一个主要问题。我们在预实验中也遇到