摘要：观察柴胡有效成分柴胡皂甙对原代培养贮脂细胞(FSC)激活及合成细胞外基质(ECM)的作用。结果：治疗组库普弗细胞条件培养基(TKCncm)、治疗CCl₄损伤库普弗细胞条件培养基(TKCtcm)、TKCncm加肝细胞条件培养基(PCncm)组FSC内结蛋白阳性反应明显减弱，对细胞表型转化的形态学特征有一定改善，各治疗组FSC的DNA合成及³H-脯氨酸掺入量均呈不同程度降低，FSC内Ⅰ型胶原含量明显减少。说明柴胡皂甙对肝细胞具有保护作用，直接抑制FSC内DNA的合成，还可抑制FSC的激活，从而抑制FSC合成ECM的能力。

A Clinical Study on the Saikosaponin on FSC Activation and

Extracellular Matrix Synthesis

Chen Shuang(陈爽),Ben Changen(贲长恩),Yang Meijuan(杨美娟),et al.

(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)

ABSTRACT: Objective: to observe the effects of Saikosaponin, an ef fective component of Bupleurum, on activating the primary cultured Fat Store Cells (FSC ) and synthesizing extracellular matrix (ECM). Method: utilizing ultrastructure, immunocytochemistry and image pattern analysis to examine contents of collagen type 1, 3, 4 and fibronectin (FN) in FSC; using flow Cytomater to determine cont ent of DNA and measure³H-Proline incorporation volume so as to detect collag en protein volume in FSC. Result: positive reaction of the desmin was markedly weak ened in the groups of TKCnem, TKCtem and TKCnem plus Pcnem. For the transformati on of cell phenotype, the morphological character was improved. In other treatme nt groups on FSC, DNA synthesis and³H-Proline incorporation volume were decr eas ed at different levels. In all treatment groups, volume of collagen type 1 was d ecreased markedly, especially groups of TKCnem and TKCtem. Conclusion: Saikosapo nin can protect the hepatocytes. It could inhibit the DNA synthesis and the FSC activation so to inhibit the ECM synthesis.

KEY WORDS: Saikosaponin; FSC; ECM; Kupffer's Cell; Immunochemistry ; Liver Parenchymal Cell

柴胡皂甙的抗炎、保肝、镇静、镇痛、增强免疫机能等效应，已为临床及实验研究所证实［1～4］。但有关其抗肝纤维化的作用及其作用机制，尤其是在体外培养条件下柴胡皂甙对原代培养贮脂细胞(FSC)的激活及合成细胞外基质(ECM)的干预作用尚未见报道。我们在肝脏细胞间调节网络的实验研究^［5～7］基础上进一步就柴胡皂甙对FSC激活及合成ECM进行了实验研究。

1材料和方法

1.1动物与试剂

雄性Wistar大鼠，以CCl₄与橄榄油等量混合，皮下注射1次(150μL/g)，4d后用于实验。试剂全部为Sigma公司产品，ABC试剂盒、兔抗鼠二抗、猪抗兔二抗为DAKO公司产品，³H-脯氨酸购自中国原子能科学研究所。

1.2肝实质细胞(PC)、库普弗细胞(KC)、FSC分离与培养

分离PC、KC选用体重140～180g大鼠；分离FSC选用体重450～550g大鼠。PC、KC分别由正常和CCl₄损伤大鼠分离获得，FSC则由正常大鼠分离获取。分离及培养方法同文献［5～7］。

1.3条件培养液的制备

由正常、CCl₄损伤大鼠分离PC、KC培养后提取培养液，分别记作贮脂细胞条件培养基(PCncm)、CCl₄损伤库普弗细胞条件培养基(KCncm)、库普弗细胞条件培养基(KCtcm)。由正常大鼠分离FSC，培养后分别提取“静息”FSC，自发激活的FSC培养液，分别记作贮脂细胞条件培养基(FSCncm)、CCl₄损伤贮脂细胞条件培养基(FSCtcm)。制备方法同文献［5～7］。

1.4实验分组

各实验组FSC以含有10%胎牛血清的DMEM培养48h后，分别换用稀释度为1∶4的KC、PC各条件培养液及其相对应的条件培养基，各相应治疗组记作“T”，同时加入50μg/mL柴胡皂甙(由中国医学科学院药物研究所提供)，以后每隔48h换液，以同样条件继续培养，至8d取样进行各项指标检测。实验分组：对照组、KCncm、KCtcm、PCncm、PCtcm(CCl₄损伤肝细胞条件培养基)、KCncm+PCncm、KCncm+PCtcm7组不加入柴胡皂甙；而T对照组、TKCncm(治疗库普弗细胞条件培养基)、TKCtcm(治疗CCl₄损伤库普弗细胞条件培养基)、PCncm、PCtcm、KCncm、PCncm、KCncm+PCtcm7组分别加入柴胡皂甙(50μg/mL)。

各实验组PC以含有10%小牛MEM培养液及其相对应的条件培养基培养4h后，分别换用无血清MEM培养液及稀释度为1∶4的KC、FSC条件培养基培养，各相应治疗组记作“T”，同时加入50μg/mL柴胡皂甙，24h后取样，进行各项指标检测。实验分组：对照组、KCncm、KCtcm、FSCncm、FSCtcm5组不加入柴胡皂甙；而T对照组、TKCncm、TKCtcm、TFSCncm(治疗贮脂细胞条件培养基)、TFSCtcm(治疗CCl₄损伤贮脂细胞条件培养基)5组均加入柴胡皂甙(50μg/mL)。

1.5透射电镜标本制备

常规清洗，3%戊二醛磷酸缓冲液固定，离心，再固定，脱水，树脂包埋，薄切80nm，电子染色，JEM-1200EX电镜观察。

1.6流式细胞仪检测细胞内DNA含量

弃去培养液，加入0.25%胰酶200～400μL，在倒置显微镜下观察，细胞稍变圆时，加入30～50μL小牛血清终止消化。用吸管反复吹打，200r/min，离心7min收集细胞，加入3～4mL无Ca²⁺、Mg²⁺PBS液，离心7min，弃上清，约留0.5mL细胞悬液，振荡使细胞分离。用注射器迅速将细胞注入70%4℃冷乙醇中，置4℃冰箱固定18h。调细胞悬液为106个/mL，加入RNA酶A(每样品50μg/mL)，至37℃水浴中孵育30min后，立即放入冰箱中，终止RNA酶的作用。加入50μg/mL碘化丙啶液，进行DNA染色。上机前尼龙网过滤。BECTONFACS420流式细胞仪，在激发光为480nm，发射光为585nm条件下，检测DNA含量。

1.7³H-脯氨酸掺入检测

每孔加入³H-脯氨酸1μci/mL，培养48h后弃去培养液，加入0.25%胰酶90μL，倒置显微镜下观察，细胞变圆后加入10μL小牛血清，吹打细胞至脱壁，49型玻璃纤维滤纸收集细胞，美国BeckmanLS5801型液体闪烁计数仪进行胶原蛋白合成总量的检测。

1.8免疫细胞化学及图像分析

以稀释度为1∶4的不同条件培养基培养24h后，取出盖玻片，用ABC免疫酶法分别检测细胞内Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型胶原和纤维粘连蛋白(FN)，并用美国TN-8502型图像分析仪测量^［7］。

2结果

2.1各组FSC表型的转化

2.1.1结蛋白免疫组化观察：各实验组结蛋白均呈阳性反应，反应颗粒呈棕褐色，位于核周，胞突内阳性颗粒较少。与对照组相比KCncm、KCncm+PCncm各处理组阳性反应明显增强。与实验组相比，相应的TKCncm、TKCncm+PCncm治疗组阳性反应呈不同程度减弱，以TKCcnm各组减弱最为明显。

2.1.2透射电镜观察：KCncm、KCncm+PCncm各处理组则表现出明显的表型转化特征，内质网增多、扩张；高尔基复合体肥大；胞膜下出现成束平行排列的微丝。与各实验组相比，相应的治疗组表现为TKCncm、TKCncm+PCncm各组FSC表型转化特征有一定程度改善。

2.2FSC内DNA含量检测

流式细胞仪检测结果是各治疗组FSC内DNA含量均明显增加，与对照组相比具有统计学意义；与相应的治疗组相比，T对照组(DMEM)、TKCncm、TKCtcm,DNA含量分别下降27.00%、17.26%、14.00%，其中以TKCncm、TKCtcm组具有统计学意义(见表1)。

2.3FSC内胶原蛋白总量的检测

各实验组FSC内³H-脯氨酸掺入量均明显增多，与对照组相比具有统计学意义；与相应的实验组相比：T对照组(DMEM)、TKCncm、TKCtcm、TKCncm+PCncm、TKCncm+PCtcm其掺入量分别下降21%、19%、28%、18%、11%；而TPCncm、TPCtcm组变化不明显(见表1)。

表1各组FSC内DNA含量及³H-脯氨酸掺入量(±s)

FSC培养条件 DNA含量(道数；n=3) ³H-脯氨酸掺入量(CPM；n=4) 治疗组 实验组 实验组 治疗组 DMEM 108.95±11.30 79.67±16.01 88.58±8.90 69.20±9.30 KCncm 337.75±10.97^** 279.44±10.07^△△ 329.18±18.09^** 267