［摘要］目的：探讨两种孕激素受体亚型（hPR-A和hPR-B）在子宫肌瘤发生、发展中的意义，为临床药物治疗子宫肌瘤提供理论依据。方法：选取30例因子宫肌瘤行全子宫切除术的标本，取肌瘤组织和正常肌层组织分别制成石蜡切片和冰冻标本。前者经免疫组化定位研究孕激素受体亚型；后者经蛋白质提取和Western印迹定量研究孕激素受体亚型的蛋白表达；从冰冻组织中提取RNA，通过逆转录-多聚酶链反应，半定量研究孕激素受体亚型的mRNA表达。结果：(1)免疫组化显示子宫肌瘤和正常肌层细胞的细胞核中，可见hPR阳性颗粒；(2)蛋白定量中hPR-(A+B)和hPR-A在子宫肌瘤的表达均高于正常肌层；子宫肌瘤和正常肌层中，hPR-B表达均明显高于hPR-A；(3) hPR-A、hPR-B和hPR-(A+B)的mRNA在肌瘤的表达量均高于周围正常肌层；(4)无论在子宫肌瘤还是在正常肌层组织中，hPR-A与hPR-B的mRNA表达量差异无显著性，与A、B亚型受体蛋白在子宫肌瘤和正常肌层的分布差异有显著性的情况不平行，提示可能存在转录后调控的差异。结论：hPR-A、hPR-B为核受体；A亚型蛋白表达在子宫肌瘤高于正常肌层；A、B亚型的mRNA在子宫肌瘤表达均高于正常肌层；孕激素受体亚型，特别是hPR-A与子宫肌瘤的发生有关。

［中图分类号］R737.33［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0483-05

Expression of human progesterone receptor isoforms A and B in uterine leiomyoma

WEI Li-Hui,TU Zheng,WANG Jian-Liu,LI Xiao-Ping,CUI Heng,QIAN He-Nian

(Department of Gynecology,Peking University People's Hospital,Beijing100044,China)

ABSTRACTObjective:To investigate the role of two isoforms of human progesterone receptor (hPR-Aand hPR-B）in the development and progression of uterine leiomyoma,their distribution and ratio of expression in leiomyoma and normal myometrium were detected respectively,that may be related to the remedy treatment for leiomyoma.Methods:The tissues of leiomyoma and normal myometrium from 30 uteri,which were excised for leiomyoma,were used for the localization and quantification of protein of the above isoforms.Immunohistochemistry and Western blot were applied respectively.Reverse transcription-polymerase chain reaction was used to detect the relative concentrations of the hPR isoforms.Results:(1)Both hPR-A and hPR-B were nuclear receptors.(2)Concentrations of hPR-(A+B) and hPR-A in leiomyoma were higher than those in normal myometrium.Both isoforms were presented in leiomyoma and normal myometrium,with a consistent dominance of hPR-B over hPR-A.(3)There were more hPR-A,hPR-B and hPR-(A+B) in mRNA of leiomyoma than those in normal myometrium.(4) hPR-A and hPR-B in mRNA expressed equally in leiomyoma and normal myometrium，which was not parallel to the expression in protein.Conclusion:Both hPR-A and hPR-B were nuclear receptors.The hPR-A in protein expressed higher level in leiomyoma than that in normal myometrium.hPR-A and hPR-B of mRNA were more in leiomyoma than those in normal myometrium.The development of uterine leiomyoma seems related to the progesterone receptor isoforms,especially hPR-A.

KEY WORDSUlterine neoplasms;Leiomyoma;Progestational hormones/metab;RNA,messenger systems/metab

子宫肌瘤是一种激素依赖性的良性肿瘤，治疗长期以来以手术为主。但对于尚未生育的子宫肌瘤患者，手术治疗具有局限性，而针对发病机制的内分泌治疗受到广泛关注。除雌激素外，不少学者报道孕激素对子宫肌瘤的发病具有重要作用，而且这种作用通过孕激素受体介导。但这些研究多数为临床观察性研究或体外细胞学研究。为了进一步探讨孕激素的作用机制，本研究从蛋白和mRNA的分子水平探讨孕激素受体亚型与子宫肌瘤发生的关系^［1］。

1材料与方法

1.1材料

选取1999年5至7月间，我院妇科收治的育龄期子宫肌瘤患者30例，均为汉族，平均年龄44.2岁（34～51岁），月经规律，手术前3个月内未服用过激素类药物，无糖尿病、甲亢等内分泌合并症，均行子宫全切术。手术切除标本均经我院病理科确诊为子宫肌瘤，结合患者月经史和子宫内膜病理诊断，17例处于分泌期，13例处于增生期。术中子宫标本离体后15 min内分别切取肌瘤部位及远离肌瘤的正常子宫肌层组织各1.0 g，液氮内保存。另取一份相同部位组织经甲醛固定，石蜡包埋备用。

单克隆抗体AB-52、B-30：美国Santa Cruz公司；单克隆抗体1A6：美国Zymed公司；单克隆抗体JZB39：美国芝加哥大学Geoffrey Greene教授惠赠；过氧化物辣根酶标记羊抗鼠抗体：美国Jackson免疫试剂公司；过氧化物辣根酶催化化学发光试剂盒：美国KPL公司；常规免疫组化试剂盒Histostain-plus SP：美国Zymed公司惠赠；Trizol试剂盒：Gibco公司；逆转录酶M-MLV及Taq酶：Promega公司；DMEM培养基：Hyclone公司。

1.2方法

1.2.1免疫组化定位研究子宫肌瘤的孕激素受体亚型分别取手术切除的子宫肌瘤及正常肌层组织石蜡块，每块连续切取5张5 μm厚的切片，1张用于HE染色核实病理诊断；另4张应用Histostain-plus SP试剂盒进行免疫组化染色。分别应用鼠抗人的单抗：识别hPR-A和hPR-B的AB-52（体积比1∶40）、1A6（体积比1∶100）和特异性识别hPR-B的B-30(体积比1∶20)；另一张不加一抗作为阴性对照。取子宫内膜组织切片作为阳性对照。

1.2.2Western印迹定量研究子宫肌瘤的孕激素受体亚型将冰冻组织匀浆，加入细胞悬浮缓冲液(10 mmol*L^－1 Tris*HCl,100mmol*L^－1 NaCl,1mmol*L^－1 EDTA,100mg*L^－1苯甲基磺酰氟)和上样缓冲液［50mmol*L^－1 Tris*HCl,100mmol*L^－1二硫苏糖醇,2%（质量分数）SDS,10％（体积分数）甘油］,提取组织总蛋白。以考马斯亮蓝法(Bradford,1976)测定蛋白含量。将100μg样本蛋白上样于8％（质量分数）聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，半干法转膜(electrotransferred to nitrocellulose filter)2h，硝纤膜在4℃含10％（质量分数）脱脂奶粉的Tris盐缓冲液中封闭过夜。一抗分别应用同时识别hPR-A和hPR-B的AB-52（体积比1∶400）、1A6（体积比1∶1000）、JZB39（体积比1∶400）和特异性识别hPR-B的B-30(体积比1∶400)，与硝纤膜室温杂交2h；二抗为1∶1000(体积比)过氧化物辣根酶标记羊抗鼠抗体，室温杂交1h；应用过氧化物辣根酶催化化学发光试剂盒进行增强发光，曝光X光胶片并冲洗。图像扫描X光胶片，测定条带密度值，测定结果以配对t检验或成组t检验进行统计学分析。

1.2.3RT-PCR半定量研究子宫肌瘤的孕激素受体亚型mRNA水平冻存组织标本匀浆以Trizol试剂盒提取组织总RNA，紫外分光光度计定量，逆转录为cDNA。根据孕激素受体的cDNA序列^［1］，设计并合成符合分子生物学实验要求的引物序列：

hPR-B特异cDNA区域的引物序列，扩增片段长度529bp

上游 5′－TCATGACTGAGCTGAAGGCAAAG-3′

下游 5′－GAGCTGTCTCCAACCTTGCAC-3′

hPR-A和hPR-B共同cDNA区域的引物序列，扩增片段长度566bp

上游 5′－TCATGAGCCGGTCCGGGTGCAAG-3′

下游 5′－CGGGGTGGACGAGGCACAGG-3′

内参GAPDH的引物序列，扩增片段长度230bp^［2］

上游 5′－ACGCATTTGGTCGTATTGGG-3′

下游 5′－TGATTTTGGAGGGATCTCGC-3′

每个cDNA样品除分别完成上述3对引物的扩增外，另配制一PCR反应体系，不加任何引物进行扩增，扩增条件同hPR-A和hPR-B共同序列，作为阴性对照。每一PCR反应至少重复3次。PCR产物于2％(质量分数)琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相，密度扫描分析仪测定扩增条带的密度值，配对t检验或成组t检验进行统计学分析。

2结果

2.1免疫组化定位孕激素受体亚型

免疫组化切片中，以同时识别hPR-A和hPR-B的AB-52和1A6作为一抗，结果相似，在部分子宫肌瘤细胞、肌层细胞及内膜细胞的细胞核中，可见阳性的黄色或棕黄色颗粒，细胞膜和细胞浆中均未见阳性颗粒（图1）。应用特异性识别hPR-B的B-30抗体，可见类似结果(图2)，但是染色较AB-52和1A6为浅。表明孕激素受体A、B亚型均为核受体。

图1子宫肌瘤组织(a)和正常肌层(b)的hPR-A和hPR-B

(抗体AB-52）免疫组化×200

Figure 1Immunohistochemistry of leiomyoma (a)