［摘要］目的：通过观察主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)在人卵巢上皮癌组织中的阳性细胞数和表达强度，了解卵巢上皮癌局部微环境的免疫状态，探讨MHC与卵巢上皮癌发生、发展的关系，为临床进行卵巢癌的生物治疗提供实验依据。方法：ABC免疫组织化学技术和图像分析。结果：在卵巢上皮癌中，HLA-I⁺细胞数量与正常卵巢组织相比较明显减少(P＜0.05)，并与临床分期和病理分级相关，而表达强度虽亦降低，但差异未见显著性；同时，HLA-DR⁺细胞数量增多，表达强度增强，且与正常卵巢组织相比较差异具有显著性(P＜0.05)。结论：人卵巢上皮癌局部微环境中MHC表达的变化在机体自身抗卵巢肿瘤免疫中起重要作用，这为临床开展卵巢癌的生物治疗提供了实验室依据。

［中图分类号］R737.31［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0496-04

The expression of major histocompatibility complex in human ovarian epithelial carcinoma

XU Li-Xin,FENG Jie,QIAN He-Nian,YAO Yu

(Gynecologic Oncology Center,Peking University People's Hospital,Beijing100044， China)

TANG Jun-Min,TANG Yan,LI Feng

(Department of Human Anatomy,Histology and Embryology,Peking University School of Basic Medical Sciences)

ABSTRACTObjective:To investigate the numbers and the expression of major histocompatibility complex (MHC) positive cells in human ovarian carcinoma tissues and provide the experimental data in the further biological therapy of ovarian carcinoma.Methods:ABC Immunocytochemistry and Computer imaging techniques.Results:The result showed that the number of HLA-Ⅰ⁺ cells as fewer in ovarian carcinoma than that of in normal ovarian tissues which were related with clinical stages and pathologic grades whereas the expressive intensity of HLA-Ⅰ had only the tendency to reduce without significant differences.On the other hand,the number of HLA-DR⁺ cells increased and its expression intensity was stronger in ovarian epithelial cancer than in normal ovarian tissues with significant differences (P＜0.05).Conclusion:The expression changes of MHC in local micro-environment of ovarian epithelial carcinoma may play an important role in initiating auto-immunity against ovarian carcinoma.These must be very useful for the further clinical biological therapy of ovarian carcinoma.

KEY WORDSGenes,MHC class Ⅰ/metab；Ovarian neoplasms/genet;Epithelial cells

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)是一组编码细胞表面蛋白分子或抗原的基因组，小鼠的MHC为H-2，而在人则称为人白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)。HLA-Ⅰ类主要负责内、外源性抗原(如肿瘤抗原)的加工和呈递。HLA-Ⅱ类，即HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ等主要参与外源性抗原的加工和呈递。肿瘤细胞表面MHC的表达密度降低或缺如，可使肿瘤不呈现或仅呈现弱的抗原性，是造成肿瘤细胞逃避宿主的免疫监视，继续增殖并发生转移的重要原因。研究表明对于某些肿瘤来说，单独一种抗原的丢失有时并不能造成肿瘤的免疫逃避，但只要MHC分子出现某一点异常，即可使肿瘤永远逃避机体的免疫杀伤^［1］。用ABC免疫组织化学技术和图像分析观察MHC在人卵巢上皮癌组织中的阳性细胞数和表达强度，可了解卵巢上皮癌局部微环境的免疫状态，探讨MHC与卵巢上皮癌发生、发展的关系，为进一步在临床进行卵巢癌的生物治疗提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料的收集及分类

收集自1993年1月～1998年11月手术切除的31例人卵巢上皮癌、16例良性卵巢肿瘤及10例正常卵巢组织，术前均未经化疗及放疗，均有病理证明并经专家再次鉴定，以上组织分别来源于北京大学第一、人民、第三医院、北京军区总院、北京妇产医院、中国医学科学院肿瘤医院。

31例卵巢上皮癌的患者年龄为25～74岁，临床分期：Ⅰ期4 例、Ⅱ期6 例、Ⅲ期20 例、Ⅳ期1 例。病理分级：高分化（G1）4例、 中等分化（G2）9例、 低分化（G3）18 例；病理类型包括浆液性腺癌、粘液性腺癌、混合性上皮癌、透明细胞癌等。

1.2组织处理及ABC免疫组织化学技术

各组织经OCT冷冻包埋，用Leica冰冻切片机切5 μm厚冷冻切片，冷风吹干，冷丙酮固定5 min，备用。

将冰冻切片用PBS(0.01 mol*L^－1 pH 7.36)洗3次(5min/次)，用0.3％(体积分数)的H₂O₂封闭内源性过氧化物酶，室温下20min。PBS洗后，加正常马血清封闭，室温30min，或 37℃ 20min。弃去血清，滴加适当稀释的抗体［HLA-Ⅰ(体积比1∶900)、HLA-DR(体积比1∶500)，均购于Pharmingen］，室温1 h，转入4℃冰箱过夜(18 h以上)。PBS洗3次，滴加生物素标记的马抗鼠IgG(体积比1∶330)，37 ℃ 1 h。PBS洗3次，滴加过氧化物酶标记的链酶卵白素(体积比1∶200)，37 ℃ 1 h。PBS洗2次，Tris-HCl缓冲液洗1次，DAB液显色，按不同抗体分别固定控制显色时间。终止显色后，水冲洗，Mayor苏木精或2％(体积比)甲绿复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，烤干后镜下观察，图像分析。

1.3图像分析

所有的冰冻切片标本进行ABC法免疫组化染色后，用Leica Q 500MC进行图像分析。每个标本随机选取不重叠的10个视野，选择每张切片的空白处进行校正，并调整灰度，然后对阳性物质进行二值化处理和图像整修，由计算机系统自动计算出阳性细胞的平均灰度和阳性细胞数，根据光密度值（OD）= Lg（空白灰度/平均标本灰度）得出平均光密度（MOD）值(表示表达强度)及标准差（s）值等。

1.4结果的统计学处理

3组间数据以±s表示。用Sta-Win软件统计包中的单因素方差分析(ANOVA)，先对3组间均数进行比较，再用t检验(t-test)进行组间两两比较。

2结果

2.1HLA-Ⅰ在不同卵巢组织内的分布及其抗原表达强度(MOD值)的比较(图1，2)

实验结果显示，HLA-Ⅰ抗原呈棕黄色，表达在阳性细胞的细胞膜和细胞质，细胞膜较细胞质着色深(图1)。卵巢上皮癌、良性卵巢肿瘤中的HLA-Ⅰ⁺细胞数较正常卵巢组织明显减少(表1)，差异有极显著性(P＜0.001)；另外，癌组织中HLA-Ⅰ⁺细胞数与临床分期和病理分级有关(表2)。HLA-Ⅰ阳性细胞表达强度在卵巢上皮癌和良性卵巢肿瘤中较正常卵巢组织相比虽有降低，但差异没有显著性(P＞0.05，表3)，且与临床分期和病理分级无关。

表1不同抗原阳性细胞在卵巢各组织中的数量(个/视野)(±s)

Table 1The number of different antigen positive cells

in the various ovarian tissues (number/vision)(±s)

Normol ovarian

tissues Benign ovarian

tumor Ovarian epithelial

carcinoma HLA-Ⅰ⁺ 38.8±24.3 5.4±4.5^*** 7.3±5.8^*** HLA-DR⁺ 7.2±2.9 6.0±5.5 12.1±8.4^**

t-test， **P＜0.05，***P＜0.001．2.2HLA-DR在不同卵巢组织内的分布及其抗原表达强度(MOD值)的比较(图3，4)

结果显示，HLA-DR抗原在正常卵巢组织分布于间质中，在卵巢上皮癌组织多分布于癌巢附近间质中，少数分布在癌细胞膜。呈棕黄色表达,在阳性细胞的细胞膜和细胞浆，细胞膜较细胞浆着色深。卵巢上皮癌中的HLA-DR⁺细胞数与良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织相比均明显增多，且差异有显著性(P＜0.05,表1)。另外，在卵巢上皮癌组织中，HLA-DR⁺细胞数的变化与临床分期和病理分级无关；同时，HLA-DR的表达强度在卵巢上皮癌和良性卵巢肿瘤中比在正常卵巢组织中均明显增强(表3)，且差异有显著性(P＜0.05)，并与临床分期和病理分级有关(表2)。

表2卵巢上皮癌组织中HLA与临床分期和病理分级的关系

Table 2The relationship between HLA and clinical stages and pathologic grade in the ovarian epithelial carcinoma tissues