［摘要］目的：探讨原发性高血压病人红细胞精氨酸/一氧化氮系统的改变。方法：通过核素标记测定红细胞³H-L-Arg转运的特征；一氧化氮合酶(NO synthase,NOS)改良法测定红细胞NOS活性；放射免疫法测定环磷酸鸟苷(cGMP)的含量。结果：高血压组红细胞L-Arg摄入的最大转运速率(Vmax)较正常组明显降低，但两组L-Arg转运的亲合力(Km)无差异。其中高血压组经过Y⁺通道的Vmax与正常对照组比较明显下降，Km与正常组无差别。经过Y⁺L通道的Vmax与正常对照组比较无变化，Km升高。高血压组红细胞NOS生成量及NOS活性均降低。高血压时红细胞中的cGMP的含量也较正常人明显减少。结论：高血压时红细胞利用精氨酸生成一氧化氮的能力下降。

［中图分类号］R544.1［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0557-04

Change of L-Arg/NO system in erythrocytes of essential hypertension patients

ZU Hong，ZHOU Guo-Peng

(Department of Gerontology,Peking University First Hospital,Beijing100034)

YAO Xing-Hai

(Department of Physiology,Capital University of Medical Science)

TANG Chao-Shu

(Central Laboratory,Peking Universing First Hospital)

ABSTRACTObjective:To study the change of L-Arg/NO system in erythrocytes of essential hypertension patients.Methods:The³H-L-Arg transport,NO synthase (NOS) production,NOS activity and the contents of cGMP were measured.Results:The Vmax for total transport of L-Arg via system Y⁺ deceased in erythrocytes of hypertension patients compared with control subjects,while the Vmax for the transport of L-Arg via system Y⁺L was unaffected in erythrocytes of hypertension patients.Km values for total L-Arg influx via Y⁺ system were not significantly different in erythrocytes in control or hypertension groups.The NOS activity produced and cGMP decreased significantly compared with those of the control and hypertension groups.Conclusion:The ability of erythrocytes utilizing L-Arg to produce NO is reduced when blood pressure rises.

KEY WORDSHypertension；Erythrocyte；Arginine/metab;Nitric oxide/metab

目前对高血压发病机制尚未完全阐明。已发现内皮细胞可以通过释放一些血管因子来调节血管张力，其中内皮细胞释放的内皮衍生舒张因子/一氧化氮（endothelium-derived relaxing factor/nitric oxide，EDRF/NO）具有维持血管张力，调节血压的作用。近来发现红细胞也有精氨酸/一氧化氮系统^［1］，可以生成一氧化氮，具有调节自身及其周围组织生理功能的作用。目前对原发性高血压病人红细胞精氨酸/一氧化氮系统研究很少，本文通过观察高血压时红细胞膜精氨酸的转运、细胞内NOS活性、生成量的变化，探讨红细胞精氨酸/—氧化氮系统的改变在高血压发病学上的意义。

1材料与方法

1.1研究对象

病例选择及分组：（1）原发高血压组按WHO高血压诊断标准（收缩压≥140 mmHg，和/或舒张压≥90 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa），选择14例原发性高血压病患者，按WHO分期，Ⅰ期6人，Ⅱ期8人，平均年龄（57.2±8.0）岁，其中男性12名，女性2名，均除外高脂血症、糖尿病、心肌梗死、心绞痛、脑血管病、原发性肾疾病等。平均动脉压（120.6±12.7） mmHg。（2）对照组10名，体检身体健康的成年人10例，男7例，女3例，平均年龄（52.0±5.2） 岁，平均动脉压（86.5±6.4）mmHg。

1.2红细胞采集及制备

晨起肘正中静脉取血5 ml，38 g·L^－1枸椽酸钠（体积比1∶9）抗凝，离心（1 400×g，10min）后去上清，再加入4倍体积的(mmol·L^－1) NaCl 140；KCl 5；D-glucose 5；Mops10(pH7.4)，离心（4 ℃1 400×g，10min）洗3次，吸去上清及上层淡黄色层，再重新离心洗3遍。之后红细胞悬浮于改良的Hank's平衡盐溶液中（MHBSS）（1mmol·L^－1，pH7.4），取部分悬液用于红细胞计数。

1.3红细胞L-精氨酸转运

为了去除细胞内物质浓度变化通过跨膜刺激对跨膜转运的影响，将红细胞在无任何底物的环境中37 ℃孵育3 h，以达到零转运状态。在零转运状态下，可以通过用N-ethylmalmide(NEM)抑制Y⁺载体，从而将转运分为Y⁺和Y⁺L两种。将红细胞悬液用0.2 mmol·L^－1NEM在25 ℃下抑制15min，后用2-mercaptoethanol(10mmol·L^－1)终止反应。后将红细胞洗涤、沉淀，以供转运测定。

取1ml MHBSS红细胞悬液（1×10⁷cells/ml），放入成对的离心管中，分别加入不同浓度的³H-L-精氨酸（5～400 mol·L^－1），37 ℃孵育5min，测量L-精氨酸的初始摄入。之后用冷等张溶液MgCl₂107；Mops10（pH7.4）冲洗细胞，用0.1%（体积比）三硝基甲苯X-1000.5ml，超声10s溶解细胞。用5%（体积比）三氯乙酸1ml沉淀蛋白，之后用β-液闪烁计数仪测定放射活性。细胞悬液中的蛋白含量用改良的Micro-lowry法测定。经NEM处理后的红细胞［³H］-L-精氨酸摄入由Y⁺L系统介导，未被NEM抑制的［³H］-L-精氨酸摄入减去Y⁺L介导的摄入即可得Y⁺介导的摄入。

1.4红细胞NOS的提纯及NOS活性的测定

1.4.1NOS提纯将红细胞（5×10⁷cells）反复冻融及超声5 s溶解，离心，获得溶血产物，再加入50mmol·L^－1 Tris-HCl，取10 ml加入2 ml 2′，5′-ADP-agarose平衡缓冲液，孵育10min后，经过加热柱提纯。NOS经过DEAE-BioGel A离子交换柱提取，再经过50mmol·L^－1 Tris-HCl，1mmol·L^－1DDT，120 mmol·L^－1 NAC洗提。蛋白浓度用改良的micro-Lowry法测定，以牛血清白蛋白为标准。

1.4.2NOS活性测定在100 μl提纯的NOS（20 μg）中，加入0.5 mmol·L^－1 NADPH，1.5mol·L^－1 CaCl₂，50μmol·L^－1 Tetrahydr-bioptein，74×10³Bq［³H］-L-精氨酸，总容积120ml，空白对照用MHSS代替，37 ℃孵育15min，加入2ml冷终止液30 mmol·L^－1 HEPES，3mmol·L^－1 EDTA pH5.5，经Dowex AG 50W-X8（Ns⁺型）阳离子交换层析柱，4ml水提取，加入闪烁液，用β-液闪烁计数仪测定［³H］-胍氨酸浓度。

1.5红细胞cGMP含量测定

红细胞悬液与0.1 mmol·L^－1 L-精氨酸共同孵育30min，22900×g离心10s，去上清，加入50μ1乙醇，真空离心去除溶剂，红细胞重新悬浮于300μ1缓冲液中，50 mmol·L^－1 Tris-HCL，4mmol·L^－1 EDTA，pH7.5，振荡10min，离心，取100μl上清用放免法测cGMP。红细胞cGMP含量以每5×10⁷红细胞中cGMP的量(pmol)表示。

1.6统计学方法

实验结果以±s表示，用非配对t检验，及相关回归进行统计学处理，以P＜0.05为差异有显著性，以P＜0.01为差异有极显著性。

2结果

2.1原发性高血压患者一般情况

14例高血压患者的平均动脉压明显高于对照组［（120.6±12.7）mmHg比(86.5±6.4)mmHg，P＜0.05］，但两组间年龄无明显区别［(57.2±8.0)岁比(52.0±5.2)岁，P＞0.05］。

2.2高血压时红细胞L-Arg的转运

从表1可以看到，红细胞膜L-Arg的转运呈高亲和型，高血压时红细胞L-Arg的总摄入的最大转运速率（Vmax）较正常对照组明显降低［每10⁷细胞（3.64±0.14）nmol·min^－1比(5.43±0.20)nmol·min^－1，P＜0.01］，但两组L-Arg转运的亲和力（Km）无差异。正常对照组通过Y⁺通道介导的最大转运速率为每10⁷细胞（4.50±0.27）nmol·min^－1，底物与载体的亲和力为（35.5±4.7）μm，高血压组Vmax明显下降为每10⁷细胞（2.62±0.19）nmol·min^－1，与正常对照组差异有显著性（P＜0.001)，底物与载体的Km为（34.0±7.0）μm，与正常组差别无显著性，说明Y⁺通道介导的L-Arg转运在高血压时下降。比较Y⁺L通道的活性，发现在正常组及高血压组转运的Vmax差别没有显著性，而Km在高血压时是增加的。

2.3高血压红细胞NOS的活性及cGMP含量

高血压组红<