［摘要］目的:探讨幽门螺杆菌临床分离株的毒素鉴定方法。方法:临床分离幽门螺杆菌HB1菌株，以国际标准株NCTC 11637（VacA⁺ CagA⁺）和NCTC 11639（VacA^－ CagA⁺）为参照，运用细胞培养、PCR、Western blot等技术对HB1进行细胞毒素鉴定。结果:HB1菌株可诱导HeLa细胞发生空泡变性，经PCR检测含cagA基因，Western blot显示87×10³及130×10³处有蛋白条带。结论:HB1菌株为VacA⁺ CagA⁺菌株。

［中图分类号］R939.1［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0564-03

The methods of identifying the cytotoxin in Helicobacter pylori

WANG Hua-Bing,DONG Xiu-Yun

(Department of Gastroenterology,Peking University Third Hospital,Beijing100083,China)

ABSTRACTObjective:To investigate the methods of identifying the cytotoxin in Helicobacter pylori (H.Pylori) clinical isolate.Methods:H.Pylori strain HB1 was isolated from the biopsy specimen of gastric mucosa and identified its cytotoxin by using the techniques of cell culture,PCR and Western blot.Results:HB1 strain induced vacuolation in HeLa cells.The cagA gene was detected by PCR in HB1 strain.The Western blot analysis showed there were two protein bands of 87×10³ and 130×10³ in H.pylori water extract.Conclusion:H.pylori clinical isolate HB1 was a VacA⁺CagA⁺ strain.

KEY WORDSHelicobacter pylori;Cytotoxin/VacA,CagA;Identify

自1983年澳大利亚学者Marshall和Warren首次从人胃粘膜中成功地分离培养出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）以来，Hp已成为国内外许多专家、学者研究的对象。最近Hp毒素在致病性中的重要作用引起人们广泛关注。根据目前的研究，Hp毒素主要有两种，即空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin A,VacA)和毒素相关基因A(Cytotoxin associated gene A,CagA)。根据这两种蛋白可将Hp分为两种主要类型^［1］：Ⅰ型菌株含有cagA基因，表达CagA蛋白，并产生空泡毒素；Ⅱ型菌株缺乏cagA基因，不表达CagA蛋白，不产生空泡毒素。这两型菌株分别占研究总样本的56%和16%，其余28%属中间表型，仅表达CagA或VacA。本实验利用已知毒素特性的Hp国际标准株NCTC 11637和NCTC 11639为参照，对临床分离株HB1进行细胞毒素鉴定，以求探索出一套有效的鉴定方法，以便对不同菌株作进一步研究。

1材料与方法

1.1细菌来源

NCTC 11637(VacA⁺,CagA⁺)和NCTC 11639(VacA^－,CagA⁺)由中国预防医学科学院流行病学研究所提供；HB1从十二指肠球溃疡患者胃粘膜活检标本中分离。

1.2主要试剂

cag A扩增产物为349 bp片段，引物由中国预防医学科学院流行病学研究所惠赠，序列如下：

5′-GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-3′

5′-CTGCAAAAGATTGTTTGCGAGA-3′

100bp Ladder Marker由北京大学基础医学院病理学系提供。高分子蛋白质分子质量标准为Promega公司产品。 第一抗体为混合病人血清，经Helico Blot试剂盒检测CagA抗体及VacA抗体均为阳性。第二抗体（辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG)为中山生物工程公司产品。

1.3HeLa细胞空泡变性实验

将培养3～4d的Hp刮入盛有灭菌三蒸水的小离心管中，在涡旋振荡器上充分振荡后，放－20℃过夜。取出融化后，再次振荡，12000r*min^－1离心15min，TGL-16G台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)，取上清液用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。取对数生长期HeLa细胞，消化后制成细胞悬液，调细胞数后接种于六孔板中。CO₂恒温培养箱中孵育24h，更换培养液后分别加入各型Hp细胞毒素提取液共同孵育24h。弃去培养液，以甲醇固定10min，晾干后加Giemsa染液作用20min，自来水冲洗。镜下观察细胞内是否有空泡形成，若大于50%的细胞形成空泡，则认为该菌株有空泡变性能力。

1.4多聚酶链反应（PCR）检测cag A基因

用接种环刮取1/3环细菌，悬于0.5 ml STE缓冲液中，洗涤一次，再以 200μl TE重悬，100 ℃煮沸5 min，14 000 r*min^－1离心10min，取上清进行扩增反应。经15g*L^－1琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪观察结果。分子质量标准为100 bp Ladder Marker。

1.5Western blot分析

配制80 g*L^－1分离胶和40 g*L^－1积层胶，加入电泳缓冲液。据蛋白定量结果每孔加样50μg进行垂直电泳。电泳结束后电转移至硝酸纤维素（NC）膜上。经丽春红S染色，用针尖标出作为分子质量标准的参照蛋白的位置，然后进行抗原-抗体结合反应，DAB显色。

2结果

2.1HeLa细胞空泡变性实验

阳性对照NCTC 11637毒素提取液使HeLa细胞发生空泡变性；阴性对照NCTC 11639未使HeLa细胞发生空泡变性；临床株 HB1可使HeLa细胞发生空泡变性，提示HB1菌株为VacA^＋菌株（图1）。

图1空泡变性实验×400

Figure 1Vacuolating test×400

2.2PCR检测

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外检测仪下观察可见：以NCTC 11637、NCTC 11639、HB1 3种菌株的裂解物为模板的扩增产物均出现一DNA带。据DNA Ladder Marker计算约350 bp，提示为cag A。说明3种菌株均属于cag A阳性菌株(图2)。

2.3Western blot分析

经与蛋白质分子质量标准比较（已通过丽春红S染色标记条带位置），在130×10³处，3种菌株均有条带，87×10³处仅NCTC 11637及HB1有条带，NCTC 11639条带缺如(图3)。

3讨论

十多年来，大量研究资料表明，Hp感染与胃十二指肠疾病关系密切^［2］。所有的Hp感染者在组织学上都有胃炎的表现，但大多数人并无症状，仅一小部分人发展成严重疾病(如消化性溃疡和胃癌)^［3］。目前人们对Hp的致病机制还不太清楚，但是导致临床结局不同的一个重要因素在于Hp菌株之间毒力的差异。Hp的几种毒力因子(如鞭毛的动力、粘附因子、脂多糖的内毒素、尿素酶、蛋白水解酶、磷脂酶A和超氧离子歧化酶等)存在于所有的Hp菌株，因此用上述因素并不能完全解释为什么感染Hp者会出现不同的临床后果。

图2PCR检测cagA基因

Figure 2PCR result for detecting cagA gene

1，HB1;2，NCTC11637;3，NCTC11639.

图3Western blot分析

Figure 3Western blot analysis

Hp毒素VacA 和CagA只在大约50%～60%的Hp菌株中产生，并且与胃十二指肠疾病关系密切^［4］，编码二者的基因分别称之为vacA和cagA。VacA 蛋白于1988年由Leunk等首先描述，1992年被提纯^［5］，在SDS-PAGE上表现为87×10³成熟蛋白，可导致真核细胞发生空泡变性，其目标是晚期核内体膜上的Ⅴ型ATP酶^［6］。本研究临床分离株HB1经HeLa细胞空泡变性实验显示具有空泡变性能力，提示为VacA⁺。所有Hp都具有vacA，但并非所有的Hp都有空泡毒素活性，对于这一现象的解释认为，两种Hp的vacA在DNA序列上有所不同，碱基组成上有64.8%的同源性。Cover等^［7］的研究显示，大约60%～70%的Hp菌株含有cagA基因，这些菌株均是CagA⁺，不产生CagA蛋白的Hp没有cagA基因^［8］。HB1经PCR检测具有cagA基因，由此推测亦CagA⁺。cagA基因内部存在重复序列，所以cagA基因和蛋白的大小在Hp菌株间存在差异，CagA蛋白的相对分子质量变动于120×10³～140×10³。Western blot结果显示，HB1在130×10³处可见一杂交条带，相同位置NCTC11637和NCTC11639亦有条带，进一步支持PCR检测结果。同时Western blot分析显示在87×10³处，HB1、NCTC11637有杂交带，NCTC11639条带缺如，亦支持HeLa细胞空泡变性实验。综上所述，本实验从功能到结构、从基因到蛋白质对Hp细胞毒<