［摘要］目的：研究胰岛素对猪卵巢卵泡膜细胞黄体生成素/人绒毛膜促性腺激素（luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin ,LH /hCG）受体表达的影响。方法：采用细胞免疫组化及Western blot 法分别检测LH /hCG受体的蛋白表达水平。

结果：细胞免疫组化结果显示促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）+黄体生成素（luteinizing hormone,LH）处理的细胞淡黄色着色且阳性细胞数少；而FSH+LH+胰岛素（insulin,INS）处理的细胞为深黄色着色，阳性细胞数多，FSH+LH+INS组光密度（0.353±0.013）与FSH+LH组（0.287±0.009）相比LH/hCG 受体表达明显增强,差异有显著性，P＜0.01。Western blot结果显示FSH+LH+INS组（6598±388）LH/hCG 受体蛋白分别在6×10³、5×10³、3.5×10³出现条带，而FSH+LH组（2237±395）仅在6×10³处出现条带，两组比较，差异有显著性,P＜0.01。结论：胰岛素可以增强卵泡膜细胞LH /hCG 受体的表达，这可能是PCOS合并高胰岛素血症患者卵泡发育停滞的原因之一。

［中图分类号］R977.15［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0512-03

Effect of insulin on the expression of luteinizing hormone-human chorionic gonadotropin receptor in cultured porcine theca cells

WU Xiu-Feng,ZHENG Shu-Rong,FAN Zheng-Hong,LI Hong-Zhen

(Department of Gynecology and Obstetrics,Peking University First Hospital,Beijing100034,China)

ABSTRACTObjective:To study the effect of insulin on the expression of luteinizing hormone-human chorionic gonadotropin receptor(LH/hCG receptor) of cultured porcine theca cells and look into the possible mechanism of the arrest of follicular growth in polycystic ovary syndrome(POS).Methods:The primary model of cultured porcine theca cells in vitro was established and the cells were treated differently.The level of LH/hCG receptor in the cells was checked by Western blot and cell immuno-

histochemistry methods.Results:The level of LH/hCG receptor in the cells of group FSH+LH+INS(6598±388)(0.353±0.013) was significantly higher than that of group FSH+LH(2237±395)(0.287±0.009),P＜0.01 by Western blot and cell immunohistochemistry.The expression of LH/hCG receptor in the cells of group FSH+LH+INS showed 6×10³,5×10³,3.5×10³ while group FSH+LH showed only 6×10³.Conclusion:Insulin enhanced the expression of LH/hCG receptor of cultured porcine theca cells.Hyperinsulinemia may enhance the expression of LH/hCG receptor so as to lose the regularing during menstrical period and probably the arrest of follicular growth in patients with PCOS implicated with hyperinsulinemia.

KEY WORDSGonadotropins,chorionic/metab;Insulin/pharmacol;

Receptors,LH/metab;Theca cells/metab

卵泡膜细胞在维持卵泡的完整性及其功能中起着十分重要的作用，并且是正常卵巢来源雄激素的主要生成部位，黄体生成素通过其受体——黄体生成素/人绒毛膜促性腺激素（luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin,LH /hCG）作用于卵泡膜细胞，影响着雄激素的合成。约有30%～70%的多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)患者常常合并高胰岛素血症，并认为它可能在PCOS的高雄激素血症中起作用^［1］。卵泡膜细胞LH/hCG受体的数量反映着其对LH的敏感性。关于胰岛素(insulin,INS)是否增强卵泡膜细胞LH/hCG 受体表达的研究报道很少。由于人的卵巢不仅来源有限而且处在同一个发育阶段的卵泡很少，限制了对人卵巢的分子生物学的研究，而猪在解剖及生理方面与人是最相似的，因此我们采用猪卵巢的卵泡膜细胞，在体外建立无血清原代细胞培养模型来研究INS对卵泡膜细胞LH/hCG受体表达的影响。

1材料与方法

1.1材料

本实验所用的猪卵巢由北京清河屠宰厂提供。 LH/hCG 受体抗体由美国Mayor Clinic Patrick Roche博士惠赠 。 Trizol试剂由生命科技公司生产,免疫组化试剂盒(Sp kit)及Western blot所用二抗购自中山公司(美国ZYMED公司生产)。硝酸纤维膜购自天象人(Whatman公司)。

1.2方法

猪卵泡膜细胞(theca cell,TC)原代培养：按Magoffi等^［2］的方法进行,即将取回的卵巢清洗数遍,在超净台选取直径约6mm的健康卵泡(卵泡液为草黄色),在盛有培养液的平皿中,半剖开卵泡,剥离出卵泡内膜(呈帽状),刮除附着在其表面的颗粒细胞并反复洗数次,用2.5 g*L^－1胶原酶及0.5 g*L^－1透明质酸酶及0.5 g*L^－1蛋白酶37℃摇床孵育,每10min吹打一次,共孵育50min后终止消化,洗涤离心除去酶进行细胞计数及台盼蓝活细胞计数(98%以上)。按每毫升10⁵个细胞接种于24孔培养板(内置1 cm×1cm大小的干净玻璃片,为细胞免疫组化用)及25ml培养瓶,用含10%(体积分数)胎牛血请(fetal calf serum,FCS)，0.2 mol*L^－1谷氨酰胺，链霉素100g*L^－1，青霉素100IU*ml^－1的培养液37℃，5%(体积分数)CO₂培养48h,使细胞充分贴壁，然后弃去培养液，更换为无血清培养液，并分为促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）+LH和FSH+LH+INS两组加药，作用48h(为最适反应时间)后停止反应，提取细胞蛋白。其中各药终(质量)浓度分别为FSH 25 μg*L^－1，LH 50μg*L^－1，INS 25μg*L^－1（正常的INS质量浓度＜10 μg*L^－1）。培养板中爬满单层卵泡膜细胞的玻璃片采用95%(体积分数)的无水乙醇，1%(体积分数)的醋酸及少许氯仿固定10 min,磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)洗涤后，－20℃保存备用；培养瓶中培养的细胞用于提取蛋白。

细胞免疫组化:将固定处理的含单层细胞的玻璃片,3%(体积分数)过氧化氢及10%(体积分数)羊血清封闭,1∶850(体积比)一抗37℃1h,PBST［0.01mol*L^－1PBS+0.5%(体积分数)Triton X-100］洗涤，二抗及三抗采用链酶菌抗生物素蛋白-过氧化物酶试剂盒中的二抗及三抗各37℃30min,DAB显色5min,镜下观察，用德国LEICA Q550IW型图像分析仪测灰度值进行分析。

卵泡膜细胞蛋白的提取:此实验所提取的蛋白是采用美国Life Technology公司Trizol RNA一步提取法提取RNA后的有机相提取的。裂解细胞,氯仿抽提,水相用于提取RNA,异丙醇沉淀,75%(体积分数)乙醇洗涤RNA,干燥,DEPC水溶解(用于RT-PCR)。水相下面的有机相用于提取蛋白：0.3 ml无水乙醇，4000×g,离心5 min,取上清加入异丙醇,离心弃上清，0.3 mol*L^－1盐酸胍反复处理3次,加入无水乙醇常温静置20min,离心弃上清干燥，加入10 g*L^－1SDS 50μl，50℃孵育数分钟,离心留取上清，－20℃保存备用（Western blot用）。

蛋白免疫印迹：将提取到的蛋白定量每孔上样0.5 μg，加β-巯基乙醇4 μl煮沸变性3 min,用5%(体积分数)浓缩胶100V及10%(体积分数)分离胶150V电泳约4 h,然后用Bio-Rad湿式电转仪将蛋白转至硝酸纤维膜(80V， 5 h),用50 g*L^－1丽春红染膜检测蛋白转膜情况,50 g*L^－1脱脂奶粉封闭过夜，PBST ［0.01mol*L^－1PBS +0.1%(体积分数)Tween-20］10min洗3次,一抗1∶1 000(体积比),RT全方位摇床置1 h，PBST 10min洗3次，依次1∶1 000(体积比)加入二抗及三抗，洗膜同前，Boehringer mannheim 发光试剂盒，压片，照相，Bio-Rad Molecular Analysis图像分析仪测灰度值进行分析。

1.3统计学处理

采用SPSS软件包进行统计分析，实验结果以±s表示，用ANOVA及LSD进行比较。

2结果

卵泡膜细胞培养48 h,使细胞充分贴壁后分别分为FSH+LH组及FSH+LH+INS组，加药后无血清继续培养48 h,然后对玻璃片上的单层卵泡膜细胞进行细胞免疫组化，看到黄色颗粒在细胞膜及细胞浆^［3］。FSH+ LH处理的细胞为梭形，膜浆淡黄色着色，阳性细胞数少，而FSH+LH+INS处理的细胞 变圆变短，膜浆深黄色着色，阳性细胞数多，每次实验设置平行孔3个，实验重复10次，经图像分析处理，FSH+LH组的平均光密度值为0.287±0.009，FSH+LH+INS组的平均光密度值为0.353±0.013，统计学分析FSH+LH+INS组与FSH+LH组相比，LH/hCG 受体表达明显增强,P＜0.01(图1)。

卵泡膜细胞培养48 h使充分贴壁后分别分为FSH+ LH组及FSH+LH+INS组加药，然后无血清培养48 h,提取细胞蛋白，进行SDS-PAGE 电泳，转膜，杂交。结果显示FSH+LH+INS组，LH/hCG 受体蛋白分别在6×10³，5×10³，3.5×10³出现条带，而FSH+LH组<