［摘要］目的：制备免疫基因修饰的卵巢癌肿瘤疫苗。方法：利用口蹄疫病毒的内在性核糖体插入位点（internal ribosome entry sites,IRES），通过基因克隆技术构建人B7-1、IFN-γ双顺反子逆转录病毒载体PLXSN/B7-1 IFN-γ。结果：将PLXSN/B7-1 IFN-γ转染逆转录病毒包装细胞,包装成病毒，经滴度测定后，转导卵巢上皮癌细胞系3AO，筛选稳定表达克隆，RT-PCR和免疫流式细胞测定均可证实B7-1、IFN-γ在同一转导细胞的共表达。结论：口蹄疫病毒的IRES可提供B7-1、IFN-γ的共表达。

［中图分类号］R979.1［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0492-04

The construction and its co-expression of bicistronic retroviral vector encoding human B7-1 and IFN-γ

CAO Shan-Jin,QIAN He-Nian,FENG Jie,FU Tian-Yun,YE Xue,YAOYu

(Gynecologic Oncology Center,Peking University People's Hospital,Beijing100044)

ABSTRACTObjective:For the preparation of immuno-gene modified ovarian carcinoma vaccine.Methods:Employing foot-and-mouth disease virus internal ribosome entry site（IRES）,the bicistronic retroviral vector encoding human B7-1 and IFN-γ (PLXSN/B7-1 IFN-γ) was constructed by gene cloning techniques.Results:After the package and determination of the retrovirus titer,3AO,an ovarian epithelial carcinoma cell line,was transducted by the virus.The co-expression of B7-1 and IFN-γ in a single transducted cell can be detected by RT-PCR and immuno-flow cytometry.Conclusion:The IRES of foot-and -mouth disease virus can provide the co-expression of B7-1 and IFN-γ.

KEY WORDSB7-1；Retroviridae；Interferon-γ gamma,recombinant/metab;

肿瘤的免疫基因治疗在肿瘤生物治疗中占有重要地位。已经证实多种细胞因子单独转染肿瘤细胞即可增强其免疫原性或诱导其免疫功能^［1］。多个细胞因子联合是研究热点之一。依据T细胞活化的双信号学说^［2］，增强肿瘤细胞的MHC Ⅰ类分子的表达，并且提供共刺激分子或许是肿瘤免疫基因治疗的优化组合。IFN-γ可增加MHC Ⅰ类分子的表达，并且可增加内在抗原的处理能力^［3～4］，而B7-1的转染可提供共刺激分子，因此，同时利用B7-1和IFN-γ修饰肿瘤细胞制备肿瘤疫苗，或许可为肿瘤的免疫基因治疗提供新的途径。为便于应用，我们利用口蹄疫病毒的内在性核糖体插入位点(internal ribosome entry sites,IRES)成功地构建了B7-1、IFN-γ双顺反子逆转录病毒载体，转导肿瘤细胞得到了两者的共表达。

1材料与方法

1.1主要试剂

限制性内切酶、T4 DNA 连接酶等购自Promega GIBCO-BRL 公司，DOTAP脂质体转染试剂购自Boehringer mannheim 公司。

1.2质粒载体和细胞株

人B7-1 (CD80) cDNA (PCDNA3 B7-1)由北京大学泌尿研究所邢念增博士提供，人IFN-γ cDNA(GCEN IFN-γ)由上海第二医科大学人类基因治疗中心陈诗书教授惠赠，含口蹄疫病毒内在性核糖体插入位点的质粒(PLNF2X)由美国华盛顿大学技术转让部提供。PUC18、逆转录病毒载体-PLXSN由本室保存。逆转录病毒包装细胞PT67购自CLONTECH 公司 (Clontech RetroPack^TM PT67)，小鼠成纤维细胞NIH3T3，取自美国模式物培养所，人上皮性卵巢癌细胞系3AO取自中科院上海细胞库，由本室冻存，传代培养。

2结果

2.1逆转录病毒载体B7-1的构建(图1)

人B7-1 cDNA基因编码序列为第318～第1181,其两侧为EcoR Ⅰ，位于pCDNA3之中，以EcoR Ⅰ酶切，回收1.0 kb的片段，将其插入逆转录病毒载体PLXSN的多克隆位点EcoR Ⅰ，粘端连接反应，转化TOP10，小量提取质粒，筛选正向重组克隆(PLXSN/B7-1) 。正、反向重组子经EcoR Ⅰ酶切均可释放出900bp 左右的B7-1条带，而经Sac Ⅰ酶切，正向重组子可切出3 214bp、2 004bp和1 646bp的3个片段，反向重组子则切出3 124bp、2 304bp和1 304bp的3个片段，借以鉴别。

图1PLXSN/B7-1的构建和酶切鉴定

Figure 1The construction and mapping of restriction

endonulease digestion of PLXSN/B7-1

2.2IFN-γ构建入IRES 的下游

2.2.1IFN-γ的克隆首先利用PCR克隆技术扩增IFN-γ，在IFN-γ引物上游加上Hpa Ⅰ 位点，在其下游加上BamH Ⅰ、Xho Ⅰ位点，以便于以后的克隆。IFN-γ的引物由SyberSyn公司合成。

正义链

5′-CGCTGAGTTAACATGAAATATACAAGTTATA-TCTTGGC-3′

反义链

5′-GTACGTCTCGAGGATCCTTACTGGGATGCTC-TTCGACC-3′

IFN-γ的PCR条件：dNTP选择0.2 μmol·L^－1,上下游引物均为1 μmol·L^－1，Mg²⁺ 3.0 mmol·L^－1,94℃ 1min→60℃ 45s→72℃ 45s，28个循环，15g·L^－1琼脂糖凝胶电泳回收500 bp的片段，以Klenow酶补平，克隆入PUC18 HincⅡ,平端连接反应，经蓝白斑筛选，酶切鉴定重组克隆，PUC18/IFN-γ，并采用双脱氧末端终止法进行测序(由SynerSyn公司完成)，测序结果与文献［5］、GeneBank(J00219)发表序列完全一致。

2.2.2IFN-γ构建入IRES的下游PUC18/IFN-γ经Hpa Ⅰ、Xho Ⅰ双酶切，回收500bp的片段，将其克隆入PLNF2X载体IRES下游的多克隆位点HpaⅠ和Xho Ⅰ，一平一粘定向连接，经转化TOP10，筛选、酶切鉴定重组克隆，PLNF2X/IFN-γ。PLNF2X/IFN-γ经Hind Ⅲ酶切可释放出IFN-γ，经Sma Ⅰ酶切重组克隆可切出3 094bp、1 995bp和1 429bp 3条带，空载体则切出3 094bp、1 995bp和1 029bp的3条带，重组克隆的第3条带大于空载体，借以鉴别(图2)。

图2PLNF₂X/IFN-γ的构建和酶切鉴定

Figure 2The construction and mapping of restriction

endonulease digestion map of PLNF₂X／IFN-γ

2.3将IRESIFN-γ克隆入PLXSN/B7-1

PLNF2X/IFN-γ经Sma Ⅰ、BamH Ⅰ酶切，回收含有IRESIFN-γ约900bp的片段，克隆入逆转录病毒载体PLXSN/B7-1的多克隆位点Hpa Ⅰ、BamH Ⅰ，一平一粘定向克隆，经转化TOP10,筛选重组克隆，PLXSN/B7-1 IFN-γ，酶切鉴定。其构建策略(图3)。

2.4逆转录病毒的包装及滴度测定^［6］

将编码B7-1和IFN-γ的双顺反子重组逆转录病毒载体PLXSN/B7-1 IFN-γ和空载体PLXSN，采用脂质体方法，转染逆转录病毒包装细胞PT67，操作按说明书进行。经G418筛选，大约2周后出现抗性克隆，约3周时克隆变大，采用滤纸消化法转移单克隆，扩大培养，至产病毒细胞株80％融合时，换液收集24 h的病毒液。病毒滴度的测定采用生物学方法，各筛选出一株高滴度的产病毒细胞株。

图3PLXSN/B7-1IFN-γ的构建示意图

Figure 3Diagram of the construction of bicistronic retroviral

vector of B7-1 and IFN-γ

2.5卵巢癌细胞系的转导

3AO传代24 h后，使细胞达到30%～40％汇合(confluent)，将收集的24h病毒上清，加Polybrene( Sigma )至8mg·L^－1,0.45 μm针头式滤器过滤，加入上述细胞中，感染24h后，换为完全RPMI1640，再过24h，1∶5传代入G418筛选培养基中，G418的质量浓度为600 mg·L^－1,每4～5天换液1次，至3周左右出现克隆，至克隆增大后，仍采用滤纸法消化转移克隆，每种转移4～6个克隆，此时G418质量浓度降为300mg·L^－1维持，满瓶后，再传代时撤掉G418，扩大培养。

2.6B7-1、IFN-γ在转导细胞系共表达

2.6.1RT-PCR采用GIBCO公司的TRIZOL试剂提取细胞的总RNA，利用IFN-γ的下游引物进行特异引物的反转录，然后进行B7-1、IFN-γ的聚合链酶反应。B7-1的引物由SynerSyn公司合成。

正义链5′-ATGGGCCACACACGGAGG-3′

反义链5′-TTATACTGGGCGTACACT-3′

IFN-γ的引物见上。其扩增产物分别为867bp和500bp