［摘要］目的：为研究卵巢癌的免疫治疗方法构建合适的动物模型。方法：严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠皮下接种人卵巢癌细胞系SKOV₃，同时腹腔注射人脾或外周血淋巴细胞进行免疫功能重建。观察成瘤情况；并用ELISA法检测鼠血清中人IgG含量以及流式细胞学和ABC免疫组织化学法测定鼠脾内人T细胞表型鉴定免疫重建。结果：免疫重建的小鼠成瘤率为89.6%，免疫组化证实皮下瘤保持原细胞系特征。3种方法检测发现用人外周血淋巴细胞免疫重建的效果优于用脾淋巴细胞。结论：免疫重建的荷人卵巢癌-SCID小鼠模型已初步建立成功。

［中图分类号］R979.5-332［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0488-04

The study of reconstitution of human ovarian carcinoma-severe combined immunodeficiency mice model

CUI Heng,LI Yi,CHENG Ye-Xia,FENG Jie,LIU Bei,GE Hua,QIAN He-Nian

(Gynecologic Oncology Center)

TONG Chun-Rong

(Institute of Hematology,Peking University People's Hospital,Beijing100044，China)

ABSTRACTObjective:To establish an adequate experimental animal model for the development of immunotherapeutic strategies of ovarian carcinoma.Methods:Human ovarian cancer cell line SKOV₃ was administrated subcutaneously in severe combined immunodeficiency (SCID) mice,which was reconstituted by human lymphocytes from spleen or peripheral blood.The tumor growth was observed.Human immunoglobulins in mouse serum were assayed by ELISA,and human T cells in murine spleen were evaluated by flow cytometry and immunohistologic stainings respectively.Results:The rate of the reconstituted mice was 89.6%.Immunohistologic stainings showed that the subcutaneous tumors still had the characteristics of ovarian adenocarcinoma.The results illustrated that peripheral blood lymphocytes were better than spleen cells in the reconstitution.Conclusion:The reconstituted SCID mouse model with human ovarian cancer cell line has been established successfully.

KEY WORDSImmunologic deficiency syndromes/ther;Ovarian neoplasms/ther;Immunotherapy;Disease models,animal

卵巢癌的发病率在妇科恶性肿瘤中占第2位，但其死亡率却居首位^［1］，目前所用的常规治疗方法(包括手术、化疗和放疗)难以提高其5年生存率。因此，生物治疗（特别是其中的免疫治疗）作为肿瘤治疗的第四大模式日趋重要。为进一步研究卵巢癌的生物学行为，寻找新的、更有效的免疫治疗方法，需要一个合适的实验动物模型。合适的动物模型应既可携带人类肿瘤，又具有正常的人类免疫功能。目前常用的裸鼠动物模型难以达到此要求,而利用严重联合免疫缺陷 ( severe combined immunodeficiency,SCID)小鼠构建荷人卵巢癌模型并进行人免疫功能重建国内尚未见报道，国外近年来仅见个别报道^［2,3］。本文在这方面作了尝试并获得初步成功。

1材料与方法

1.1动物、细胞系及试剂

SCID小鼠：雌性，6～8周龄，购自中国医学科学院动物所，按三级动物要求，饲养在无特定病原体环境中，所用食料、饮水、笼具及垫料均经高压灭菌。

人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞株SKOV₃中高分化，来自美国 ATCC 。

主要抗体：生物素标记兔抗鼠IgG 及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记亲和素购自美国Dako公司；羊抗人IgG 及HRP标记羊抗人IgG购自北京帮定公司；小鼠抗人CD3、CD4、CD8单克隆抗体及异硫氰基荧光素标记羊抗小鼠IgG购自北京中山生物公司；COC166-9由本室自制，是抗卵巢浆液性乳头状囊腺癌抗原OC166-9的单克隆抗体；小鼠IgG及人IgG购自北京帮定公司。

1.2SCID小鼠“渗漏”的筛查

小鼠均从眼内眦取血，离心得血清（待测样品）。采用生物素-亲和素夹心ELISA 法，以小鼠IgG纯品作标准曲线；羊抗小鼠IgG包被ELISA板，依次加入待测血清、生物素标记兔抗鼠IgG及HRP标记亲和素孵育,OPD显色,测490 nm的光密度。小鼠血清IgG小于1 mg·L^－1者为非“渗漏”型，供实验用。

1.3实验分组及模型构建

34只非“渗漏”SCID小鼠皮下接种SKOV₃细胞，每只接种3～4点，每点每0.2 ml PBS约(0.7～1.2)×10⁷细胞，随机分为3组：(1)第1组，9只作为对照组，不进行免疫重建；(2)第2组，15只，每只腹腔注射人脾来源的淋巴细胞30×10⁶～40×10⁶每0.5mlPBS进行免疫重建，其中5只从重建2周起，每周处死1～2只小鼠，取脾进行鉴定；（3）第3组，10只，其中用供者1来源的外周血淋巴细胞重建7只，用供者2 来源的重建3只，方法及细胞数量同第2组。

1.4小鼠皮下移植瘤特征鉴定

SCID小鼠皮下移植瘤组织经10%(质量分数)福尔马林固定，石蜡包埋切片。（1）HE染色，显微镜下常规形态学观察；（2）ABC免疫组化染色（一抗为COC166－9，二抗为生物素标记兔抗鼠IgG，三抗为HRP标记亲和素），显微镜下观察其是否保留了原细胞系的特征。

1.5SCID小鼠免疫重建的鉴定

1.5.1鼠血清中人 IgG含量的测定定期从免疫重建的SCID 小鼠眼内眦取血，离心得血清。以羊抗人IgG包被ELISA板，以人IgG纯品作标准曲线；依次加入血清和HRP-羊抗人IgG，OPD显色，测490 nm的光密度。

1.5.2鼠脾内人T细胞的检测（1）流式细胞学鉴定：在免疫重建的SCID小鼠死亡当天取脾，机械研磨后过200目筛网，并用淋巴细胞分离液常规分离获得脾淋巴细胞悬液。以正常人外周血淋巴细胞为阳性对照，以未重建的SCID小鼠脾细胞为阴性对照，采用流式细胞仪作T细胞表型分析。（2）免疫组化检查：取重建后SCID小鼠的脾脏，以 ABC免疫组化染色(一抗为小鼠抗人CD3单抗，其余方法同1.4)，显微镜下观察。以未重建SCID小鼠的脾为阴性对照。

1.6统计学处理

数据以±s表示，小鼠成瘤率采用χ²检验，小鼠生存期采用t检验，用SPSS软件处理。

2结果

2.1SCID小鼠“渗漏”的筛查

共检测了41只6～8周龄小鼠，其中40只的光密度在0.1～0.3之间，IgG质量浓度为（0.24±0.16）mg·L^－1；只有1只小鼠IgG质量浓度为2.3 mg·L^－1，渗漏比例为2.4%。

2.2人卵巢癌细胞系SKOV₃-SCID小鼠移植

2.2.1成瘤潜伏期和成瘤率9只未免疫重建的小鼠和20只免疫重建的小鼠(除去第2组中从重建2周起定期处死的5只)，成瘤潜伏期均为14～17 d，成瘤率分别为31/34和69/77。经χ²检验，二组差异无显著性(P＞0.05)。

2.2.2小鼠生存期9只未重建的小鼠平均生存期为(50±16)d，20只重建的小鼠平均生存期为(35±11)d，经t检验,二组差异有显著性(P＜0.01)。

2.2.3小鼠皮下移植瘤特征SCID小鼠皮下瘤结节HE染色呈典型腺癌 结构，用COC166－9 ABC染色阳性，可见细胞膜、细胞浆有明显的棕色染色。

2.3SCID小鼠免疫重建的鉴定

2.3.1鼠血清中人IgG含量的测定第2组用脾淋巴细胞重建的15只SCID小鼠，有4只可以检测到人IgG的存在，但其含量很低，只有微克级,在免疫重建后23、30、37和46 d鼠血清中人IgG水平分别为2.53、3.93、5.40和9.33 mg·L^－1。第3组用人外周血免疫重建的10只SCID小鼠，100%可以检测到人IgG的存在，其含量达到毫克级(表1)。以上二组小鼠血清中人IgG含量均随重建时间的延长而升高。对照组未检测到人IgG的存在。

2.3.2鼠脾内人T细胞的检测用流式细胞学检测第2组用人脾淋巴细胞重建的15只SCID小鼠，有6只（40%）阳性。第3组用人外周血淋巴细胞重建的10只小鼠只检测了2只均阳性。对照均为阴性(图1)。用ABC免疫组化方法在上述免疫重建成功的SCID小鼠脾内可查见人CD3^＋细胞，其细胞膜有明显的棕色染色。而未免疫重建的SCID小鼠脾为阴性。

表1人外周血淋巴细胞免疫重建后鼠血清中人IgG水平

Table 1Human IgG in mouse sera after reconstituted

with human peripheral blood lmyphocyte

ρ/(g·L^－1)

t/d Doner 1 IgG Doner 2 IgG 23 0.77±0.08 3.77±0.33