［摘要］目的：用酵母双杂合体系筛选肝细胞 cDNA文库，寻找与丙型肝炎（丙肝）病毒（hepatitis C virus,HCV）胞膜蛋白2（E2）相作用蛋白的基因，探讨HCV与肝细胞的相互作用，寻找HCV进入细胞的受体。方法：以HCV E2蛋白胞外区片段，构建酵母双杂合体系中“饵”载体，从成人肝细胞cDNA文库筛选与HCV E2相作用蛋白的基因。结果：筛出的阳性克隆基因序列分析后，经GenBank查询，与人的apo CⅢ同源,同源性为98%。结论：HCV E2蛋白能与人的apo CⅢ在酵母双杂合体系中结合，但其相互作用与HCV进入细胞间的关系待进一步研究。

［中图分类号］R512.6［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0540-03

Study on the receptor of HCV entry into the hepatocyte by yeast two-hybrid system

LIANG Qing-Hua,JIANG Dong,XIE Yao,GAO Jian-En,FAN Tao,TAO Qi-Min

(Hepatology Institute,Peking University People's Hospital,Beijing100044,China)

ABSTRACTObjective：To select the gene from human liver cDNA library which can transform the protein that can interact with HCV E2 protein by yeast two-hybrid system and look for the receptor by which HCV enters the host cell.Methods：Hepatitis C virus E2 gene without transmembrane domain was used to construct the “bait plasmid” to look for the gene from the cDNA library,which expressed the protein that could interact with the HCV E2 protein.Results：After sequencing the positive clone was provided to the GenBank.It showed that the cDNA was homologous to the human apolipoprotein CⅢ (identities 98%).Conclusion：HCV E2 protein can interact with human apoC Ⅲ in the yeast two hybrid system.But the relationship of the HCV-vLDL and the HCV entering the host is still being studied.

KEY WORDSHepatitis C virus;Viral envelope proteins;Lipoproteins,VLDL;Yeasts;Hepatitis C

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是导致经血液传播非甲非乙型肝炎的主要原因。其特征为较高的慢性化（70%以上）、持续感染，可导致肝癌、肝硬化及自身免疫性疾病。HCV感染具有宿主特异性。这有碍于HCV的体外研究。其宿主特异性又取决于病毒入胞的受体特异性，而HCV的入胞机制目前还不清楚^［1］。

HCV属于黄病毒属,有包膜。其基因组编码两个包膜糖蛋白E1(gp31)和E2(gp70)。重组的E1/E2蛋白免疫黑猩猩后，能起到一定的保护作用^［2］。缺乏E2单独表达的E1蛋白并不能离开内质网，而E1的正确折叠又需要与E2的共同表达。而E2蛋白能够独立正确表达，E2又是HCV的主要膜蛋白，含有中和表位^［3］，因此，能够通过研究E2阐明HCV与细胞作用的机制。

1材料与方法

1.1载体的构建

1.1.1“诱饵”克隆的建立（图1）将不含疏水区的HCV E2基因片段E2-661，以T₄连接酶连于含GAL4结合结构域的pAS2-1载体上构成诱饵质粒pAS2-1-E2-661，转入酵母细胞后，Western blotting^［4］鉴定是否有融合蛋白的表达，用滤膜法排除其自身激活作用。

1.1.2对照克隆阳性对照有：（1）表达DNA-BD/p53融合蛋白的载体pVA3-1，编码AD/SV40大T-抗原融合蛋白的载体pTD1-1,p53蛋白能够与SV40大T-抗原结合。（2）含有野生型全长GAL4基因的载体pCL1。阴性对照：在pAS2-1中装有核膜蛋白序列的载体pLAM5′-1。

图1pAS2-1-E2-661“诱饵”质粒构建

Figure 1Construction of pAS2-E2-661 “bait” plasmid

1.2cDNA文库的滴定、扩增及质粒提取

成年人肝细胞的cDNA 文库购自Clontech 公司，cDNA 片段克隆于含GAL4激活结构域的pACT2载体上。文库滴定后，按其容量的4倍（1.4×10⁷个克隆）进行扩增，收集菌体，以碱裂解法提取质粒^［4］。

1.3酵母菌株及培养基

AH109（trp,leu,his,ade2基因缺失，带有由3个不同启动装置MEL1,GAL1,和 GAL2所控制的报告基因LacZ，his,ade2）用YPD培养基培养，转化DNA结合结构域质粒后，用色氨酸营养缺乏培养基选择性培养（SD/-trp）,转化cDNA文库后，用4种氨基酸营养缺乏培养基选择性培养（SD/-trp,leu,his,ade2）。

1.4酵母转化方法

用乙酸锂转化法^［5］。共转化后的酵母培养于SD/-trp,leu,his,ade2营养选择性培养基，30℃温育7 d。

1.5LacZ活性测定

用滤膜转印法。将共转化后，生长于SD/-trp leu,his,ade2中的菌落分别印迹到无菌Whatman 滤纸上，液氮中浸泡10～15s，2次，将滤纸菌面向上，置于浸有Z缓冲液/x-gal的滤纸上面，防止气泡产生，30 ℃温育，在25min～8h变蓝的菌落为阳性克隆,超过8h变蓝的为假阳性。

1.6分离实验排除Ⅰ类假阳性

利用分离实验^［6］排除Ⅰ类假阳性（AD：cDNA 融合蛋白不与BD融合蛋白结合，自身能够激活报告基因；或者同时有多个pAD：cDNA转入了酵母，而其中之一具有自身激活作用）。将阳性克隆在无选择培养液YPD中培养过夜，再转入SD/-leu培养液中培养过夜后，将其稀释10倍，取100μl 铺于SD/-leu培养皿中，30℃温育3d，再将其分别接种于SD/-trp,SD/-his和SD/-trp,leu培养皿中，标明方向，30 ℃温育1～2d。然后根据各个克隆在不同的选择性培养基上的生长情况进行判断，结论可能有4种情况：(1）真阳性;(2）假阳性（即AD：cDNA自身激活报告基因）;(3）真阳性，但酵母细胞中同时还存在另一个无自身激活作用的pAD：cDNA;(4）自身激活作用的假阳性细胞中同时还存在另一个无自身激活作用的pAD：cDNA。

1.7回转实验

用玻璃珠破细胞法^［5］提取阳性酵母中的质粒，同时用CaCl₂法将其转入大肠杆菌中^［4］，扩增、提取、纯化后，对质粒进行分析。

双酶切电泳分析质粒，将片段大小相同者进行归类（图2），再将同一类质粒以克隆位点两侧的引物做PCR扩增各克隆的插入片段。PCR产物纯化后，用HaeⅢ酶切分析鉴定相同的克隆（图3）。最后，将没有重复的真阳性pAD：cDNA质粒，分别回转入含有pAS2-1-E2-661的酵母AH109。铺于SD/-trp,leu,和SD/-trp,leu,his,ade2中，再次鉴定真阳性，同时可以评价分离实验的效果。

图2阳性克隆的酶切鉴定

Figure 2Positive clones verified by restriction endonucleases

1.8确认第Ⅱ、Ⅲ类假阳性

将所筛阳性pAD：cDNA质粒分别转入含有阴性对照质粒pLAM5′-1和空质粒pAS2-1的酵母细胞中，用SD/-trp,leu,his,ade2培养基排除第Ⅱ、Ⅲ类假阳性。

1.9DNA序列分析

阳性克隆测序后，提交GenBank数据库。

2结果

2.1“饵”载体的构建

“饵”载体pAS2-1-E2-661能在酵母细胞中稳定表达E2-661蛋白，没有报告基因激活作用，能够用于酵母双杂合的筛库工作。

图3阳性克隆的HaeⅢ酶切鉴定

Figure 3Positive clones verified by restriction endonucleases HaeⅢ

2.2文库筛选

用100 μg的cDNA质粒转化含有pAS2-1E2-661的酵母AH109，在SD/-trp,leu培养基上得到5×10⁶转化子，其转化子数大于cDNA文库的容量4.5×10⁶个克隆。因此，转化效率可保证被筛文库的完整性。在SD/-trp,leu,his,ade2培养基上得到68个大而饱满的阳性克隆。将其经LacZ活性测定，35个为LacZ⁺。分离及回转实验筛选后，排除了相同克隆及假阳性克隆。最后对6个进行了测序。

2.3阳性克隆的DNA序列分析

对筛选出的具有代表性的阳性克隆进行序列分析。用载体pACT2多克隆位点的上游引物，对融合于GAL4的开放读码框架（ORF）进行测序。结果提交GenBank数据库后，其中2个与人的apoCⅢ同源,同源性98%(图4）。

3讨论

酵母双杂合系统是一种在体内研究蛋白<