［摘要］目的：研究克服^99mTc标记抗癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）单抗体内生物半衰期长、血液廓清速度慢、晚时相放射性信号弱等缺点的方法,用直接标记法进行了^99mTc标记抗CEA抗体C50片断Fab’的研究。方法:经胃蛋白酶切得的C50片断F(ab’)₂用适量的2-巯基乙醇还原，Sephadex G50柱分离获得纯度大于90%的Fab’片断。取0.6～1.0 mg纯化的片段Fab’(体积＜1.0 ml),加入0.4～0.8 mg葡庚糖酸钠及新鲜配制的SnCl₂溶液5～10μg,然后加入新鲜淋洗的Na^99mTcO₄淋洗液,反应10～15min。用高压液相色谱监测放化纯度和抗体纯度。荷CL-187（结肠癌）裸鼠静脉注射^99mTc-Fab’，观察标记抗体片段在不同时相的体内分布。结果：标记率大于90%。荷瘤裸鼠体内分布结果显示：在注射^99mTc-Fab’ 4 h后瘤/血、瘤/肝、瘤/肺放射性摄取比分别为1.93、2.35和3.13，24 h后则分别为4.91、2.62和5.26，肿瘤的ID(%)/g（每克组织的摄取率）为2.73。虽然注射^99mTc标记的全抗C50后24 h，肿瘤的ID(%)/g高达12.5，但瘤/血比值仅为1.51。结论：采用^99mTc直接法标记Fab’是成功的，肿瘤与非肿瘤（T/NT）的比值除肾外在早期4 h时均大于2.0，明显高于全抗的T/NT比值，有利于在注射后短时间内获得清晰的图像，因而^99mTc-C50 Fab’是很有希望的放射免疫显像药物。

［中图分类号］R730.4［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0536-04

Studies of^99mTc labeled carcinoembyronic antigen monoclonal antibody C50 fragment Fab’ and biodistrobution

YANG Zhi,LIN Bao-He,HAN Yan,MU A-Ping,ZHANG Mei-Ying

(Department of Nuclear Medicine,Peking University School of Oncology，Beijing100036，China)

KONG Jian

(National Vaccine and Serum Institute)

ABSTRACTObjective:To study^99mTc labeled anti-CEA antibody C50 fragment Fab’ and its biodistribution.Methods:F(ab)’₂ of C50 was reduced by 2-mercapthonal and purified by Sephadex G50 column.Fab’ was obtained with a purity of over 90%.0.6-1.0mg Fab’(＜1.0 ml) was mixed with 0.4-0.8 mg glucoheptonate,followed by adding 5-10 μl freshly prepared SnCl₂ solution (1.0mgSnCl₂ in 0.01mol·L^－1 HCl).Then about 1.0ml of freshly eluted Na ^99mTcO₄ was added to the mixture mentioned above and the mixture was slightly shaken.The solution was incubated at room temperature for 15 min.The labeling efficiency was determined by HPLC or ITLC-SG method.Nude mice bearing CL-187 tumor xenografts were injected with^99mTc-Fab’ via vein tail and the ID(%)/g (% injected doses /g) of organs were obtained at various time points of postinjection.Results:The labeling efficiency of^99mTc-Fab’ was more than 90%.The ratios of tumor to blood,liver and lung were 1.93,2.35 and 3.13 4 hours after injection.In addition,these ratios reached up to 4.91,2.62,and 5.26,24 hours after injection respectively.4 hours and 24 hours after injection of ^99mTc-Fab’,the ID(%)/g of tumor was 4.53 and 2.73 respectively.Although at the 24 th hour,the ID(%)/g of tumor of ^99mTc-C50(intact) reached up to 12.5,the ratio of tumor/blood was only about 1.5.Conclusion:^99mTc labeled Fab' was successfully prepared by direct labeling technique,and the T/NT ratios were more than 2.0 except that with the kidney which was significantly higher than that of^99mTc-labeled C50 (intact).These are favorable to get clear images at earlier time after injection of ^99mTc-Fab'.These indicate that ^99mTc-C50 Fab' seems to be a good radiopharmaceutical for RII.

KEY WORDS^99mTc;Antibodies,monoclonal;Carcinoembryonic antigen;Isotop labeling

由于^99mTc在核医学诊断上具有优良的核物理性能,近年来广泛用于标记各种单克隆抗体进行放射免疫显像研究。全抗的生物半衰期一般都较长，与^99mTc的物理半衰期不相匹配，而影响了使用。抗癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)抗体C50亚类为IgG₁，直接进行^99mTc的标记在用药后短时间内很难获得高清晰度的图像（血液清除缓慢，T/NT比值较低），需进行双时相采集，而延长检查时间，延迟相（20～24h）采集时放射性信号较弱，需采集较长时间才能累积足够的信号。于是我们在成功地用^99mTc标记抗胃癌单抗3H11的基础上^［1，2］，又进行了^99mTc标记抗CEA抗体C50片段的研究。

1材料与方法

1.1试剂和仪器

2-巯基乙醇（2-mercapthonal,2-ME），氯化亚锡和葡庚糖酸钠（glucohetonate,GH）均为AR级，Sigma公司产品；C50抗体由北京市生物制品研究所提供，Sephadex G50进口分装，SPECT由Sopha公司提供，Waters 510 HPLC为Waters公司产品，紫外分光光度计由发玛西亚公司提供。

1.2实验方法

1.2.1抗体片段Fab’的制备及其标记

抗体C50在适量的胃蛋白酶和反应介质作用一段时间后,进行纯化分离和浓缩,而获得抗体片段F(ab’)₂。抗体片段F(ab’)₂经2-ME还原获得片段Fab’,方法与文献［1］介绍的相似。反应一定时间后用Sephadex G50柱分离,用电泳法检测还原后抗体的相对分子质量。将纯化后的抗体片段Fab’分装,保存于－70℃的低温冰箱中,备用。

取纯化的抗体片段Fab’ 0.6～1.0mg(体积＜1.0ml),加入0.4～0.8mg GH及新鲜配制的SnCl₂溶液5～10μg,再加新鲜淋洗的Na^99mTcO₄淋洗液,反应10～15min，最终反应的pH为7.2。

全抗C50的还原和标记方法同前。

1.2.2标记率及稳定性的测定

柱层析：采用Sephadex G50柱（100 mm×8 mm），用0.01 mmol*L^－1 pH7.2的PBS淋洗，上柱体积0.2ml，收集各淋洗液于0.5ml的试管中，共20管，分别测定各管中的放射性活度和280nm处的紫外吸收。

将快速薄层层析-硅胶纸（ITLC-SG）裁成10 cm×1.0 cm的小条，于110℃的烘箱中烘烤30 min，置于干燥器中密封保存待用。将标记溶液1～2μl 点于活化的ITLC-SG距底端1cm处，2min后分别置于两种体系中行上行展开。第一种为在生理盐水体系中，游离^99mTc迁移到前沿，标记抗体留在原点；第2种为水、乙醇、氨水体积比为5∶2∶1体系,在此体系中,先将点样纸条点上7.5×10^－4mol*L^－1的人血清白蛋白后再点样。胶体留在原点，其余组分展开到前沿。当展开到10cm左右，吹干，剪成10条，用定标器测定放射性计数，计算标记率。

采用Waters 510高压液相色谱仪（high-pressure liquid chromatography,HPLC）和蛋白分析柱及紫外和放射性双重检测装置进行标记抗体分析。淋洗剂为pH 7.2的0.01 mmol*L^－1的PBS，淋洗速度为1.0ml*min^－1，淋洗时间为20min，所得信号用计算机处理。

观察^99mTc-Fab’在7.5×10^－4 mol*L^－1的人血清白蛋白和生理盐水及0.05mol*L^－1的二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid,DTPA)中的稳定性，用ELISA法测定标记抗体活性。

1.2.3荷瘤裸鼠模型的建立及其生物分布取6～7周龄的裸鼠，每只右腋下接种CL-187结肠癌细胞2×10⁶，饲养于SPF级动物房。待肿瘤生长至100mg左右（约2周,直径约0.6cm），各组动物（每组5只）经尾静脉注射标记物^99mTc-Fab’或^99mTc-C50 0.1 ml(7.4 MBq),于γ照相机下经不同时间观察放射性分布及肿瘤显像情况.用药后4 h和24 h分别处死、解剖，测定组织重量及放射性计数，计算ID(%)/g。

2结果

采用胃蛋白酶法切割C50，F(ab’)₂的产率约为30%,用电泳法检测,纯度(质量分数)大于95%.用2-ME将F(ab’)₂还原,纯化分离后得到Fab’,纯度约为90%.电泳谱带显示:全抗C50的相对分子质量为16万,F(ab’)₂的相对分子质量为11万,Fab’的相对分子质量为5万～6万之间HPLC的紫外吸收峰显示：Fab’组分中含有10%(质量分数)左右的F(ab’)₂。

^99mTc标记C50全抗和Fab’的标记率＞90%。标记后的抗体用ELISA法测定免疫活性均＞80%。经除菌滤膜过滤后，标记抗体细菌和热源均符合静脉注射要求。