［摘要］目的：克隆在肝癌组织中低表达的差异显示片段L2的基因cDNA序列，并初步探讨其在肝癌发生、发展过程中的作用。方法：将L2在GenBank中拼接后，分析其序列结构，并构建正义真核表达质粒，转染BEL-7402肝癌细胞后，对转染细胞增殖、粘附、迁移和侵袭等指标进行测定。结果：克隆得到一条1 005 bp的cDNA，其5′端712bp与人Liprinβ1 cDNA 5′端调控序列和外显子1，2，3序列同源(100%)，而3′端293bp与Liprinβ1基因内含子4同源(100%)。其间有一个510 bp开放阅读框架，起始密码位置与Liprinβ1基因相同，推断的蛋白产物除C端13个氨基酸残基外，其余均与Liprinβ1同源。此cDNA暂命名为LHS (Liprinβ1-homologous sequence)。LHS cDNA正义转染BEL-7402肝癌细胞系，对于细胞的增殖活性和侵袭能力无明显影响，但可降低肝癌细胞在层粘连蛋白上的粘附和迁移能力。结论：LHS表达下调可能在肝癌的转移过程中起重要作用。

［中图分类号］R735.7［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0526-04

Partial cloning of LHS cDNA and effect of its expression on behavior of hepatocellular carcinoma cells

LIU Jun-Jian,ZHANG Jie,ZHOU Rou-Li

(Department of Cell Biology,Peking University School of Basic Medical Sciences,Beijing 100083)

JIN Cheng

(Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences)

ABSTRACTObjective:To clone cDNA sequence of differential expressed fragment L2 which preferentially down-regulated in hepatocellular carcinoma (HCC),and to preliminarily study its biological function in hepatocarcinogenesis.Methods:Homologous sequences were spliced with L2,and the structure of the spliced gene was analyzed.Sense eukaryotic expression plasmid of the candidate cDNA was constructed，and the proliferation,adhesion,migration and invasion of the transfected BEL-7402 HCC cells were analyzed.Results:A 1 005 bp cDNA was cloned.5′-end 712 bp sequence of the cDNA was homologous (100%) to 5′ non-encoding sequence and exon 1,2,3 sequence of Liprin β1 gene,while 3′-end 293bp sequence of the cDNA was homologous to intron 4 of Liprin β1 gene.The cDNA was temporarily termed LHS (Liprinβ1-homologous sequence).There was an open reading frame of 510bp in LHS cDNA sequence,and the position of initiation codon was the same as that of Liprinβ1.Except for the last 13 amino acid residues,LHS was homologous to Liprinβ1 at protein level.BEL-7402 cells transfected with sense sequence of LHS cDNA showed lower ability for adhesion and migrating,while no effect on proliferation and invasion was observed.Conclusion:The down-regulation of LHS expression may play an important role in HCC metastasis.

KEY WORDSCloning,molecular;Gene expression;Carcinoma,hepatocellular/drug eff;DNA,circular;Neoplasm metastasis

肝癌是我国主要的致死肿瘤之一，目前，肝癌临床治疗仍面临一定的问题，因而从分子水平研究肝癌发生、发展和转移的机制，对肝癌的预防、诊断和治疗有极其重要的意义。近年来，已发现了一些基因的结构、表达在肝癌中异常变化^［1，2］，但肝癌发生、发展的复杂机制还远未阐明。进一步寻找肝癌相关基因，分析其功能，仍然是肝癌基础研究中的重要课题。本室以前的研究发现差异显示片段L2 (482bp)在正常肝、癌旁肝组织中表达较强，而在肝癌组织、胎肝中表达下调^［3］。本研究拟克隆其基因cDNA序列，并初步探讨其表达对肝癌细胞行为的影响。

1材料与方法

1.1试剂

TRIZOL试剂、Taq DNA聚合酶和lipofectamine购自Gibco BRL公司；AMV逆转录酶购自Amersham公司；pGEM-T easy试剂盒购自Promega公司； DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ购自Boehringer Mannheim公司。

1.2组织总RNA的提取和细胞培养

癌旁肝组织取自邮电总医院，组织离体后立即放入液氮中冷冻，然后置－70 ℃冻存。按一步法^［4］提取总RNA。BEL-7402肝癌细胞系为本室保存，细胞在含10% (体积分数)小牛血清的RPMI-1640培养基，5% (体积分数) CO₂培养箱内37 ℃培养。

1.3L2片段在GenBank中的拼接

以BLAST程序在GenBank数据库中检索与L2片段有较高同源性的基因或EST片段，通过拼接使其序列向5′端或3′端延伸。

拼接结果用RT—PCR法证实。依据拼接得到的序列—LHS (Liprinβ1-homologous sequence)，设计一对PCR引物，上游引物a (－108～－83)：5′ GGA TCA CTT TGC TGA GTA CAT CCA AG 3′，下游引物c (+519～+544)：5′ CAC AAC ATA GAA ATG CAG CAT CTC AC 3′。以随机引物逆转录癌旁组织总RNA后，进行PCR，反应条件为：94 ℃ 3min；94 ℃ 1min，55 ℃ 1min，72 ℃ 2min，30个循环；72 ℃ 10min。克隆PCR产物LHS-ac至pGEM-T easy载体中，命名为pTE-LHS，测序确证其序列。

1.4LHS正义真核表达质粒的构建

EcoR Ⅰ酶切pTE-LHS，低熔点胶回收0.65kb LHS-ac片段，正向插入真核表达质粒pcDNA3.0的EcoR Ⅰ位点，命名为pcD-LHS，用于转染BEL-7402肝癌细胞系。

pcDNA3.0质粒0 kb处有1个Hpa Ⅰ位点，其多克隆区有BamH Ⅰ、Eco RⅠ和Xba Ⅰ位点，分别位于0.91、0.94、0.98kb处，插入片段LHS-ac 0.47kb处有1个Hpa Ⅰ位点，这些位点可用于鉴定LHS-ac的插入方向。

1.5转染BEL-7402 HCC细胞系

用lipofectamine介导法按Gibco BRL试剂操作说明进行转染。以800mg·L^－1 G418筛选3周后，挑取单克隆细胞培养扩增。pcD-LHS转染的细胞称LHS-7402细胞，对照为BEL-7402细胞和以pcDNA3.0空质粒转染的细胞(mock-transfected,MOCK)。

提取LHS-7402细胞和对照细胞的总RNA，以每孔样品20 μg点膜，进行斑点杂交。以地高辛标记LHS-ac片段为探针，进行杂交，以进一步明确筛选的细胞克隆含有目的基因。

1.6转染细胞增殖、粘附、迁移和侵袭的检测

1.6.1细胞增殖的检测将细胞接种至50 ml培养瓶(10⁴个细胞/瓶)，每24h取3瓶细胞计数，计算其平均值。连续计数6 d，绘制生长曲线，作为细胞增殖活性指标。实验重复2次。

1.6.2结晶紫法检测细胞粘附将细胞接种至包被层粘连蛋白的96孔板(2×10⁴个细胞/孔)。培养箱4～6h后，用Hanks液轻柔漂洗细胞3次以去除未粘附的细胞。粘附细胞经1%(体积分数)甲醛固定、5 g·L^－1结晶紫染色、PBS漂洗3次、10g·L^－1 SDS 100μl彻底裂解后，酶标仪上测定波长595 nm吸光度，作为细胞粘附指标。每组设4复孔作为平行样。实验重复4次。

1.6.3Boyden Chamber法检测细胞迁移在Boyden小室下室中加入趋化因子(3T3细胞培养液上清)200 μl，以聚碳酸酯膜将上下室隔开，在上室中加入细胞悬液(5×10⁵个细胞/毫升) 400 μl，继续培养18h。取出聚碳酸酯膜，擦去膜上面未侵入膜中的细胞，经甲醇固定，苏木精染色，乙醇逐级脱水，二甲苯透明后，用中性树脂封片。光镜下随机取6个视野(100倍)，计数穿过膜的细胞数，作为细胞粘附指标。实验重复2次。

1.6.4Boyden Chamber法检测细胞侵袭在Boyden小室下室中加入趋化因子200μl，以聚碳酸酯膜将上下室隔开，在上室中加入Matrigel (2.4g·L^－1，50μl)，置37℃ 30 min使Matrigel聚合成凝胶，其余操作均同上。1.7统计方法

采用单因素方差分析和q检验分析细胞实验中各组间指标值的差异。P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.1L2片段在GenBank中的拼接

在GenBank中检索结果显示482bp L2片段第1～347bp与人Liprinβ1 cDNA (Acession No:AF034802)^［5］同源(100%)，而第169～482bp与EST片段AI478372同源(100%)。

拼接以上3条序列后得到一条长1 005 bp的cDNA，其5′端712bp与Liprinβ1 mRNA 5′调控序列及外显子1、2、3序列同源(100%)，3′端293bp与Liprinβ1 基因内含子4的5′端序列(见Homo sapiens 12p11-37.2-54.4 BAC RP11-1060J15克隆GenBank报告，Accession No.：AC009509)同源(100%)。其中含有一个510bp (+1～+510)的开放阅读框架，起始密码位置与Liprinβ1 cDNA相同，推断的蛋白产物除C端13个氨基酸外，其余均与Liprinβ1相同。此cDNA暂命名为LHS (Liprinβ1-homologous sequence) (图1)，GenBank登录号为AJ276680。LHS cDNA 3′端无poly A尾，表明3′端不完整，但3′<