［中图分类号］R979.1［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）06-0569-01

cAMP对多种细胞的增殖和分化有重要的影响。长期以来人们寻找对癌细胞增殖和分化有作用的cAMP类似物。现有大量研究表明8-Cl-cAMP及其代谢产物8-氯腺苷(8-Cl-Ado)对肿瘤细胞有抑制作用^［1～3］,但它的抑癌作用机制尚不清楚。细胞周期的运行受诸如细胞周期蛋白、生长因子、癌基因蛋白等因子的调控。如一些癌基因蛋白(如P16、P21、P53等)的缺失或突变就会引起细胞的癌变。

本文以人肝癌细胞系Bel-7402为对象,研究在8-Cl-Ado作用下肝癌细胞周期变化与IGF-1及P21含量变化的关系，以探讨8-Cl-Ado的抗癌作用的可能机制。

1材料与方法

1.1材料

8-Cl-Ado和Bel-7402肝癌细胞系:由北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室合成并提供，IGF-1 mRNA的cDAN由美国糖尿病消化病研究所惠赠,P21单克隆抗体购自上海市肿瘤研究所免疫室,亲和素-生物素免疫检测试剂盒购自华美生物工程公司, IGF-1购自美国Sigma公司,IGF-1mRNA试剂盒购自Boehringer Mannheim公司。北京医用离心机厂制造LD5-2A型离心机。

1.2方法

流式细胞分析：取状态良好的单层Bel-7402细胞,弃去培养液,加入无血清的DMEM,饥饿8 h后, 加入8-Cl-Ado使其终浓度为6 μmol·L^－1,37 ℃培养24 h后，加0.25 g·L^－1胰酶,37 ℃培养2 min,制成单细胞悬液，用70%(体积分数)乙醇4 ℃固定30 min,800 r·min^－1离心5min,弃上清 ，用PBS调节细胞为每毫升1.0×10⁶, 加10μl(10 g·L^－1)RNase置37 ℃温育30 min,用300目尼龙筛网过滤于试管中，加碘化丙啶250 μl染色上机测试。

IGF-1放免测定：取状态良好的单层Bel-7402细胞，无血清DMEM饥饿8h培养后，加入终浓度为6μmol·L^－1的8-Cl-Ado作用24h后，收集细胞并计数(每瓶约3×10⁷细胞)，蒸馏水破碎细胞，加酸化乙醇(总体积为1.5ml)过夜，12000r·min^－1离心10min，取0.5ml上清液加0.2ml 0.855mol·L^－1 tris中和，中和液经稀释，取0.1ml作IGF-1 RNA测定，方法见参考文献［4］。

IGF-1 mRNA原位杂交测定；cDNA探针的地高辛标记按试剂盒方法进行。将Bel-7402细胞接种于带有玻片的24孔培养板中，待细胞贴壁后，加入无血清的DMEM饥饿8 h后，加入8-Cl-Ado使其终浓度变为6 μmol·L^－1，37 ℃培养24 h后，吸去培养液用PBS洗1次,用丙酮∶甲醇(体积比)=1∶1固定15 min，弃去固定液，再用PBS洗3次后,每片加20 μl(20 ng)蛋白酶K作用15 min，用PBS洗3次,用4 g·L^－1多聚甲醛固定10min，PBS洗3次。原位杂交按地高辛检测试剂盒提供的方法酶联免疫显色。用LEICAQ 5501w图像分析仪对原位杂交显色作灰度扫描读取平均光密度值。

P21蛋白的免疫组化测定：Bel-7402细胞6 μmol·L^－1 8-Cl-Ado作用24h后，用丙酮固定5min，弃去固定液，用PBS洗1次加1%(体积比)H₂O₂作用15min后，用PBS洗3次用滤纸吸干。P21蛋白的免疫组化测定按ABC免疫法，DAB显色法，最后用LEICA Q 5501W图像分析仪对免疫组化显色进行灰度扫描读取平均光密度值。

2结果

2.18-Cl-Ado对细胞周期的影响

流式细胞术分析指出:6 μmol·L^－1的8-Cl-Ado作用Bel-7402细胞24h后，使G₁期的细胞数由（52.1±1.4)%增至(69.8±1.5)%，而S期细胞由(39.3±1.1)%降至(23.2±1.3)%，差异十分显著，说明8-Cl-Ado使肿瘤细胞阻止在G₁期，肿瘤细胞增殖受到抑制。

2.28-Cl-Ado对Bel-7402细胞IGF-1mRNA表达及胞内IGF-1含量的影响

原位杂交和放免测定结果显示：8-Cl-Ado作用24 h后，使胞内IGF-1 mRNA的表达水平由0.188±0.026降至0.120±0.028(P＜0.01)，胞内IGF-1含量由(254±105)降至(110±25) pg/10⁶细胞(P＜0.05)。说明肿瘤细胞内IGF-1 mRNA表达水平和IGF-1含量均明显下降。

2.38-Cl-Ado对Bel-7402细胞中P21蛋白表达的影响

组化分析结果显示：8-Cl-Ado使Bel-7402细胞中P21蛋白表达水平由（0.240±0.008)降至(0.192±0.019)(P＜0.01)，作用十分显著。

3讨论

本研究证明8-Cl-Ado能够抑制肿瘤增殖作用，并使肿瘤细胞被阻止在G₁期，细胞内P21表达水平下降。此结果与参考文献［1,2］报道一致。G₁期细胞向S期细胞转变受IGF-1的控制，IGF-1减少细胞就会被阻止在G₁期。不仅如此，它还受细胞周期蛋白D、E、A及其依赖的蛋白激酶CDK4，CDK2的调控，P21蛋白既能与周期蛋白D-CDK4或周期蛋白E-CDK₂结合，从而抑制CDK的活性，又能与增殖细胞核蛋白(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)结合，抑制DNA的复制，因此，在正常细胞的增殖过程中，P21作为细胞负调节因子起抑制细胞增殖作用，但是，在肿瘤细胞中，P21丢失与PCNA结合的功能，使DNA甲基转移酶的活性增强，从而削弱其抑癌基因的功能^［5，6］。

本研究表明，在一定浓度(6 μmol·L^－1)范围内8-Cl-Ado可以抑制癌细胞增殖，使癌细胞停滞在G₁期，胞内P21蛋白水平IGF-1 mRNA以及IGF-1含量均下降，这些结果至少提示8-Cl-Ado使癌细胞停滞在G₁期的部分原因可能是细胞分泌IGF-1减少，而导致生长因子受体信号通路中P21蛋白表达下降，从而抑制癌细胞生长。但是8-Cl-Ado抑癌作用的靶点需进一步研究。

参考文献

1，Lang-Carter CA,Vuillequez JJ,Malkinson AM,et al.8-chloroadensine mediates 8-chloro-cyclicAMP-induced down-regulation of cyclicAMP-dependent protein kinase in normal and neoplastic mouse lung epithelial cell by a cyclic AMP-independent mechanism［J］.Cancer Res,1993,53:393-400

2，Ally S,Clair T,Katsaros D,et al,Inhibition of growth and modulation of gene expression in human lung carcinoma in athymic mice by site-selective 8-Cl-cyclic adenosine［J］.Cancer Res,1989,49:5650-5655

3，方家椿，石永进，张礼和，等.8-氯腺苷的抗肿瘤作用的研究［J］.中华肿瘤杂志,1995,17:5-8

4，贺师鹏,黄天贵,邓鸿业,等.胰岛素样生长因子-1的放射免疫分析及其应用［J］.中华核医学杂志,1996,16:127

5，Baylin St.Tying it all together:epigenetics,genetics,cell cyclic and cancer［J］.Science,1997,277:1948-1949

6，徐耀先,解梦露,张锡元.从细胞周期蛋白与抑癌蛋白的调控看肿瘤发生的机制［J］.肿瘤,1997,17:298-301

收稿日期；1999-02-26