［摘要］ 目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：应用抑制性差减杂交技术（suppression subtractive hybridization, SSH）,构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库，结合RACE及RT-PCR进一步克隆并验证新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因，获得了差异表达的cDNA片段，克隆后挑选阳性克隆进行测序，成功克隆8个新基因片段。对其中两个新基因克隆C55和C91进行Northern杂交分析，mRNA转录体长度分别为1.4 kb及1.5 kb,C55的表达在两种胸腺基质细胞系中存在显著差异。进一步克隆了C55和C91两个新基因的cDNA全长序列，已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片段的有效方法；成功克隆8个新基因片段及两个新基因的cDNA全长序列。

［中图分类号］ Q343.12［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0303-03

Molecular cloning of novel genes involved

in T cell development using suppression subtractive hybridization

JIN Cheng-Gang

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

LI Yan

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

CHEN Wei-Feng

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

ABSTRACTObjective: To clone and characterize novel genes which might be involved in T cell development.Methods: A subtracted cDNA library of mouse thymic stromal cell lines was constructed using suppression subtractive hybridization. RACE and RT-PCR were used to clone and verify the full-length cDNAs.Results: Differentially expressed gene fragments were obtained and sequencing revealed that 8 clones represented novel gene cDNAs, including C55 and C91.Northern blot analyses of C55 and C91 showed that the mRNA transcripts were 1.4 kb and 1.5 kb, respectively. Further, the expression level of C55 mRNA was significantly different between the two thymic stromal cell lines. The full-length cDNAs of C55 and C91 have been successfully cloned and accepted by GenBank.Conclusion: suppression subtractive hybridization is an effective method to clone novel genes; Eight novel gene clones were obtained and two full-length cDNAs cloned.

KEY WORDSSuppression subtractive hybridization; Cloning, molecule; Thymus gland/genet; DNA, circular

(J Beijing Med Univ, 2000,32:303-305)

T细胞发育相关新分子和新基因的研究，有助于深入了解T细胞发育、分化和成熟的确切机制。为研究胸腺细胞与胸腺基质细胞间的相互作用，我室建立了多株胸腺基质细胞系（ thymic stromal cell lines）。其中MTEC1为小鼠胸腺髓质型上皮细胞系,MTDC为小鼠胸腺树突状细胞系。体外实验证实，MTEC1具有抑制胸腺细胞凋亡的作用；而MTDC则能促进小鼠胸腺细胞的凋亡^［1］。本实验应用抑制性差减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH),研究MTEC1和MTDC的差异表达基因并克隆出胸腺基质细胞的新基因。

1材料与方法

1.1细胞系和细胞培养

MTEC1及MTDC均来源于BALB/C小鼠胸腺，由我室建立，体外传代培养。培养基为DMEM（GIBCO BRL），内含抗生素及10%(体积分数)的新生牛血清。

1.2细胞总RNA和mRNA提取

采用GIBCOBRL公司的TRIZOL^TM试剂，按实验说明进行操作，提取总RNA,溶于无RNase的水中，经琼脂糖凝胶电泳及分光光度计（Beckman 640）鉴定质量后，保存于－70℃冰箱中备用。采用poly(A)Tract mRNA分离系统（Promega）,获得高质量 mRNA ，用于双链cDNA合成。

1.3双链cDNA合成

采用Clontech公司的PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit中 的试剂和酶按说明操作，模板分别为MTEC1和MTDC的mRNA。

1.4差减杂交文库的建立

采用Clontech公司的PCR-Select^TM cDNA Subtraction Kit，原理详见文献［2］。常规SSH方法完全按说明书进行。简述如下：MTEC1和MTDC cDNA互为Driver和Tester，进行差减杂交。将Tester的cDNA分为两份，分别连接试剂 盒提供的特殊设计的寡核苷Adapter 1和Adapter 2，然后与Driver cDNA进行杂交；合并两种杂交产物后再与Driver cDNA作第2次杂交；然后将杂交产物做选择性PCR扩增，使Tester cDNA中特异性表达或高表达的片段得到特异性扩增。扩增产物与pT-Adv载体连接,转化TOP10’菌，进行克隆化，然后提取重组质粒DNA进行测序。 测得序列,利用Internet进入GenBank数据库进行同源性比较和分析。

1．5Northern blotting杂交分析

将序列分析后显示可能来自新基因的cDNA片段 C55和C91进行³²P标记作成标记探针，用MTEC1和MTDC的总RNA进行Northern杂交分析。Hybond-C硝酸纤维膜为Amersham Life Service 公司产品，按分子克隆进行操作^［3］。

2结果

2.1差减杂交文库的建立

常规SSH完全按说明书进行，杂交产物经PCR扩增后，经凝胶电泳，显示条带，这些差异条带可能代表差异表达的基因片段（图1）。

1， DNA marker; 2， tester: MTDC, driver:MTEC1;

3， tester:MTEC1, Driver：MTDC.

图1差减杂交PCR产物电泳图

Figure 1Electrophoresis of PCR products after

subtractive hybridization

2.2阳性cDNA克隆的分离和序列分析

对采用SSH方法杂交后PCR产物克隆化，经DNA测序，与GenBank数据库进行同源性比较。结果发现，在所测的序列中，8个cDNA克隆为小鼠未知的新基因的片段；5个cDNA克隆与猪或大鼠相关的基因高度同源，但在小鼠中尚未克隆成功；7个cDNA克隆为小鼠已知的基因片段（表1）。

表1阳性克隆测序及GenBank同源序列比较结果

Table 1Sequencing and GenBank homology search of positive clones

Clones Homology Percentage Size(bp) Tester C22 M.BGAL 95 386 MTDC C24 M.Lama5 94 378 MTDC C26 unknown － 156 MTDC C27 M.γ-actin 98 259 MTDC C29 M.A-X actin 91 287 MTDC C32 unknown － 87 MTDC C33 unknown － 222 MTDC C35 M.SYT 95 363 MTDC C40 unknown － 148 MTDC C49 unknown － 473 MTDC C52 R.L27 95 279 METC1 C54 R.L27 95 270 METC1 C55 unknown － 200 METC1 C61 R. Clone Ch4A-RC5 94 380 METC1 C62 R. Clone Ch4A-RC5 96 284 METC1 C72 P. endopeptidase 96 311 MTDC C78 unknown － 386 MTDC C91 unknown － 452 MTDC C98 M.Rab11b 99 377 MTDC C102 M.sid23p 97 297 MTDC

2.3Northern blotting杂交分析

对两个新基因克隆C55（Tester为MTEC1）和C91（Tester为MTDC）进行Northern blot 杂交分析。结果<