［摘要］ 目的：研究Yaa基因与骨髓B细胞系细胞的分化发育是否有相互关系。方法：用Whitlock-Witte法从骨髓细胞中培养纯化出B细胞系细胞，继而检测B细胞系细胞对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激后的表型、增殖反应和抗DNA抗体的产生以及对地塞米松诱导后的凋亡情况。结果：用Whitlock-Witte法成功地从骨髓细胞中培养分离出B细胞系细胞。经LPS刺激后，雌雄BXSB小鼠B细胞系细胞膜表面CD19抗原和膜表面Ig的分布相似，都出现较强的增殖反应和产生IgM类型的抗ssDNA和dsDNA 抗体，但是对地塞米松诱导的凋亡作用不敏感。结论：Yaa基因对BXSB小鼠骨髓中B细胞系细胞的分化发育无影响，提示Yaa基因仅在外周免疫器官的成熟B细胞中表达活性；并且BXSB小鼠骨髓中的自身反应性B细胞系细胞未被删除，可能是产生自身抗体的内在原因之一。

［中图分类号］ R758.62-332［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0320-04

Study on the differentiation and development of bone marrow B

cell lineage cells from systemic lupus erythematosus BXSB mice

XU Zhi-Wei

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

DENG Hong-Ye

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

DENG Yu-Lan

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

DING Gui-Feng

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

ABSTRACTObjective： To obtain B cell lineage cells from the bone marrow of lupus BXSB mice and observe whether there is an interrelation between the Yaa gene and B cell lineage differentiation.Methods： B cell lineage cells were isolated with Whitlock-Witte method, and their surface phenotype， proliferation， production of anti-DNA antibody after response to lipopolysaccharide (LPS) and apoptosis status induced by dexamethasone were detected.Results:B cell lineage cells derived from male or female BXSB mice had identical distribution of CD19 and surface membrane Ig , proliferative response with similar intensity and produced approximate levels of IgM anti-DNA antibodies after LPS stimulation. Besides , the B cell lineage cells were resistant to the Dex- induced apoptosis.Conclusion: Yaa gene has no effects on the differentiation and development of the bone marrow B cell lineage cells in SLE BXSB mice, suggesting that its activity only appears in the peripheral mature B cells. The autoactive B cell lineage cells in the bone marrow of BXSB mice are not deleted, which maybe is one of the intrinsic reasons of producing autoantibodies.

KEY WORDSB-cell activation antigen/isol; Bone marrow cells/growth; Lupus erythematosus, systemic; Autoantibodies/biosyn; Gene Yaa

(J Beijing Med Univ, 2000,32:320-322)

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus， SLE）是由于免疫复合物形成而造成多器官损伤的自身免疫性疾病。但其病因及发病机制仍不明朗。近来，对遗传背景不同的SLE小鼠模型进行了多方面的研究表明，由于B细胞的内在缺陷导致其表型异常和功能亢进是SLE发生的主要细胞学基础。在SLE小鼠模型BXSB品系，由于Yaa(Y chromosome associated -autoimmune accelerator)基因的作用，使得雄性小鼠发病早且严重，而雌性小鼠发病迟且相对轻，这与雄性小鼠外周淋巴器官中出现Yaa基因相关的B细胞异常有关，包括对脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的高增殖反应，膜表面粘附或辅助分子的高表达以及出现异常的CD40配体分子等^［1］。骨髓移植实验证明，雄性BXSB小鼠的早发病与造血干细胞有关，那么Yaa基因是否与骨髓中B细胞系的分化发育相关有待澄清。为此，本实验对BXSB小鼠骨髓B细胞系细胞进行了分离培养，并进一步检测分析了在诱导剂的作用下骨髓B细胞系细胞的分化和凋亡的情况。

1材料与方法

动物：BXSB小鼠，3周龄，雌雄各3～5只（该小鼠由第三临床医学院皮肤科陈学荣教授自美国Jackson实验室引进，本研究室饲养繁殖）。

优质胎牛血清（FCS）（Hyclone），RPMI1640(Gibco), PE-CD19mAb(深圳晶美公司)，FITC-RaMIg(本室制备)，组织培养板及培养皿（Falcon）。

骨髓B细胞系细胞的体外培养与分离，采用Dorshlick介绍的Whitlock-Witte方法^［2］。获取小鼠后肢骨髓细胞，用含体积分数5%的胎牛血清的RPMI1640培养液配成1×10⁶ml^－1细胞浓度，放入6孔组织培养板内，每孔3ml，在37℃和体积分数5%的CO₂条件下培养。第3天时加入3ml的含体积分数5%的FCS的RPMI1640培养液（下同）。此后的第3天弃去80%的培养液，加入1.5ml的培养液。以后每周半量换培养液2次。

收集B细胞系细胞：用尖吸管吹打悬起细胞，然后将细胞转移到新的组织培养皿中，在37℃和体积分数5%的CO₂条件下放置2 h。此时饲养细胞贴壁，将处于悬浮状态的B细胞系细胞收集，洗涤。再用含体积分数10%的FCS的RPMI1640培养液配成1×10⁶ml^－1的细胞浓度。

将细胞放入24孔细胞培养板，每孔1 ml，加LPS至终(质量)浓度20 mg*L^－1，在37℃和体积分数5%的CO₂条件下，连续培养3 d。收集细胞，用PE-CD19mAb和FITC-RaMIg对细胞进行双染色，上流式细胞仪分析。

用上述方法连续培养5 d后，收集上清，用ELISA法测定IgM和IgG类型抗ssDNA和dsDNA抗体^［3］。

将上述相同细胞浓度和相同LPS质量浓度的细胞悬液，加入96孔培养板，每孔0.2 ml，在相同条件下培养48 h，然后每孔加入7.4×10⁵Bq的³H-TdR，继续培养24h。收获细胞，用Wallac仪测定细胞内参入DNA中的³H-TdR的放射性活度。

细胞悬液加入终浓度为10^－6mol^．L^－1的地塞米松，在37℃和体积分数5%的CO₂条件下培养12h。收集细胞，用PI染色。经流式细胞仪测量亚二倍体细胞数量作为凋亡细胞的含量。

2结果

骨髓细胞经过1周的培养后，可见较小的B细胞系细胞集落。经过3周培养后，可见B细胞系细胞形成的较大集落或密集分布于饲养层细胞下面。

从雌雄BXSB小鼠骨髓细胞中培养分离出的骨髓B细胞系细胞，经LPS作用后，细胞表面的CD19抗原和膜表面Ig抗原的分布极为相似（图1）。近90%的细胞表达CD19抗原，其中Ig阴性的B细胞与Ig阳性的B细胞的比例接近1∶1。CD19抗原阴性的细胞可能是更加原始的细胞。

A, male BXSB mice; B, female BXSB mice.

图1Pre-B细胞系细胞膜表面CD19和Ig抗原的分布

Figure 1CD19 and SmIg distribution on Pre-B lineage cells

雌雄BXSB小鼠的骨髓B细胞系细胞一般不能自发产生IgM和IgG类型的抗ssDNA和dsDNA的抗体。在体外经LPS刺激后，雌、雄BXSB小鼠的骨髓B细胞系产生IgM类型的抗ssDNA抗体［光密度D(±s)分别是1.09±0.08和0.89±0.24］和抗dsDNA抗体［D(±s)分别是1.20±0.06和0.82±0.14］，前者的水平稍高于后者；但是，雌雄BXSB小鼠的骨髓B细胞系细胞均不产生IgG类型的抗DNA抗体。

雌雄BXSB小鼠的骨髓B细胞系细胞对LPS刺激有非常明显的增殖反应。雌性BXSB小鼠骨髓B细胞系细胞的增殖反应［活度(±s)是(2 254±148)Bq］稍高于雄性BXSB小鼠的骨髓B细胞系细胞［活度(±s)是(1 723±100)Bq］。

雌雄BXSB小鼠的骨髓B细胞系细胞对地塞米松的凋亡诱导作用不敏感，经10^－6mol^．L^－1浓度的地塞米松作用12h后，两者均不到10%的细胞出现凋亡（图2）。此与小鼠胸腺细胞不同，我们在以前的实验中用相同浓度的地塞米松处理相同时间，大于80%的胸腺细胞出现凋亡。

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