［摘要］ 目的：建立高效简便的人重组粒细胞集落刺激因子突变体rhG-CSF-Ala-17纯化工艺，并对其进行鉴定。方法：大肠杆菌表达的rhG-CSF-Ala-17经包涵体洗涤、变性复性后，采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化。经SDS-PAGE和FPLC检测纯度，并进行N端氨基酸序列分析、比活性分析、紫外最大吸收光谱分析、内毒素检测等指标对其进行鉴定。结果：纯化后的rhG-CSF-Ala-17纯度可达99.64%，比活为1×10⁸ U*mg^－1。其N端19个氨基酸分析与预期序列一致，紫外最大吸收光谱位于280 nm，氨基酸的组成与预期结果一致，内毒素含量低于部颁标准。结论：两步层析即可获得高纯度的rhG-CSF-Ala-17重组蛋白质，为进一步的rhG-CSF-Ala-17临床前和临床研究打下了基础。

［中图分类号］ Q343.13［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0337-03

Purification and identification of recombinant human granulocyte

colony-stimulating factor muteint (rhG-CSF-Ala-17)

FAN Hui

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

MO Xiao-Ning

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

ZHANG Ying-Mei

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

YANG Lu

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

SONG Quan-Sheng

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

FAN Zhong-Yu

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

MA Da-Long

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

ABSTRACTObjective: To establish a cost-effective procedure for the purification and identification of rhG-CSF-Ala-17.Methods: The inclusion body of the rhG-CSF-Ala-17 recombinant protein expressed in E.coli was washed, denatured and renatured. The two steps of chromatography (DEAE Sepharose FF ion exchange and Supexdex 75 size exclusion) were used for the purification. The purity and properties of the recombinant protein was detected by SDS-PAGE, FPLC, amino acid analysis, ultravidet (UV) absorption and endotoxin analysis.Results: Following the procedure, up to 99.64% rhG-CSF-Ala-17 can be achieved and there is no endotoxin contamination. The bioactivity of the recombinant protein is 1×10⁸U/mg; the maximal UV absorption is at 280 nm, and the N-terminal amino acid analysis shows that the first 19 amino acids sequence is the same as the theoretic prediction.Conclusion: We have established a purification procedure for rhG-CSF-Ala-17 with highly efficiency and simplicity. It will make a base for preclinical and clinical trials of rhG-CSF-Ala-17.

KEY WORDSPoint muteint; Escherichia coli; Granulocyte colony-stimulating factor/isol

(J Beijing Med Univ, 2000,32:337-339)

人重组粒细胞集落刺激因子突变体rhG-CSF-Ala-17是利用基因工程技术将野生型人重组粒细胞集落刺激因子rhG-CSF进行改造，使其具有更稳定的结构。有更高的体内活性和体外稳定性^［1］，弥补细胞因子类药物稳定性差、体内半衰期短的弊端，更利于运输贮藏和广泛应用。本文在大肠杆菌表达成功rhG-CSF-Ala-17的基础上^［1］，进一步对其蛋白质纯化工艺进行研究，通过表达、包涵体洗涤、变性、复性、二步层析程序，建立了一套高效快速的分离纯化技术路线。

1材料与方法

1．1质粒与菌株

rhG-CSF-Ala-17蛋白表达质粒pKpL- GCSF-Ala17由本室构建^［2］。大肠杆菌pop2136(C600衍生株，含C1857基因，编码温度敏感的λ阻遏蛋白)，由Raiband博士惠赠。

1．2介质及纯化设备

DEAE Sepharose Fast Flow, Superdex75 16/60预装柱及低压层析设备均为Pharmacia产品。

1．3rhG-CSF-Ala-17的表达及纯化

质粒转化及诱导表达技术按本室方法进行^［2，3］，rhG-CSF-Ala-17工程菌经超声破碎后洗涤包涵体，利用含100mmol^．L^－1 β-ME 的8 mol^．L^－1尿素进行变性，离心取变性上清，在缓冲液中（50mmol^．L^－1 Tris-HCl pH 8.0）稀释复性。复性液先通过DEAE Sepharose Fast Flow进行阴离子交换层析，直线梯度洗脱，于0.2 mol^．L^－1 NaCl洗出目的蛋白，洗出的蛋白峰经浓缩后过凝胶过滤Superdex 75 16/60预装柱，收集rhG-CSF-Ala-17蛋白峰。

1．4rhG-CSF-Ala-17的蛋白质鉴定

rhG-CSF-Ala-17蛋白的纯度检定选30 g^．L^－1浓缩胶，125g^．L^－1分离胶，非还原SDS-PAGE电泳，银染色分析蛋白带。rhG-CSF-Ala-17相对分子质量检定选用30g^．L^－1浓缩胶，125g^．L^－1分离胶还原型SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色。

rhG-CSF-Ala-17蛋白的生物学活性测定以NFS-60白血病细胞株为依赖株（由中国生物制品检定所丁锡申教授惠赠）选用MTT法进行检测。

紫外最大吸收光谱分析于BECKMAN DU640型紫外可见分光光度计进行220～400 nm紫外全波长扫描。

等电点的测定用等电聚焦法测定G-CSF-Ala-17蛋白等电点，选用Pharmacia产Phast System电泳仪。

氨基酸成份分析采用酸解法于日立885-50型氨基酸自动分析仪进行分析测定，委托我校细胞生物学教研室检测。

N-端氨基酸序列测定选用Edman降解法于BECKMAN LT3000测序仪测定，委托中国医学科学院基础所检测。

内毒素检测采用家兔热原检测法及鲎试剂法，参照《中国生物制品规程（一部）》生物制品热原质试验规程进行。

2结果

2．1rhG-CSF-Ala-17蛋白的纯化

rhG-CSF-Ala-17蛋白在大肠杆菌以包涵体形式表达，经变性，复性，DEAE Sepharose Fast Flow层析样品于0.2 mol^．L^－1 NaCl洗出纯度达66.17%（图1）。再经Superdex75层析分离，得到纯蛋白（图2），经非还原SDS-PAGE检定为单一蛋白带，相对分子质量为18.3×10³（图3、4），FPLC检测为单一峰型，纯度达99.64%。自原始工程菌10.5%的表达量至终产品纯化倍数为9.52倍，表1对纯化的效率进行了总结。

表1rhG-CSF-Ala-17分步纯化效果

Table 1The purification of rhG-CSF-Ala-17

Step m/mg Recovery

(%) Specific

protein (%) Purification

fold Engineered E.coli － － 10.5 － Indusion bodies － － 21.6 2.06 Renature solution 14.8 100 35.3 3.36 DEAE-SepharoseFF 4.37 29.53 66.7 6.35 Superdex75 2.53 17.09 100 9.52

Column 1.6 cm×3 cm flow rate 5 ml^．min^－1;

peak2， rhG-CSF-Ala-17．

图1DEAE Sepharose FF阴离子

交换层析分离rhG-CSF-Ala-17

Figure 1DEAE Sepharose FF ion exchange chromatographic

profile of rhG