［摘要］ 目的：比较rhTRX与rhTRXδ3对细胞因子依赖株TF-1细胞、NFS60细胞撤除细胞因子所诱导凋亡的抑制及促细胞增殖作用。方法：在大肠杆菌中克隆并表达重组hTRX和hTRXδ3，纯化rhTRX与rhTRXδ3蛋白，FACS检测凋亡细胞，MTT法检测细胞增殖。结果：在依赖IL-3、GM-CSF生长的TF-1细胞（人红白血病细胞）和依赖G-CSF生长的NFS60细胞（小鼠白血病细胞）撤除细胞因子后，加入rhTRXδ3比加入rhTRX能更有效地抑制这两种细胞的凋亡并有促增殖的作用。结论：重组hTRX和hTRXδ3有着不同的生物活性，rhTRXδ3有着更强的抑制这两种细胞的凋亡和促增殖的作用。

［中图分类号］ Q251［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0328-04

Human thioredoxin and its isoform inhibit apoptosis

and stimulate growth in TF-1 and NFS60 cells

WANG Ying

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

DI Chun-Hui

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

ZHANG Ying-Mei

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

SONG Quan-Sheng

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

MA Da-Long

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

ABSTRACTObjective: To compare cytoprotective activity against cytokine withdrawal-induced apoptosis and a growth-promoting effect between rhTRX and rhTRXδ3 in GM-CSF-dependent cell line TF-1 and G-CSF-dependent cell line NFS60.Methods: rhTRX and rhTRXδ3 are purified after cloning and expressing in E.coli., analysing apoptotic cells by fluorescence activated cell sorting(FACS), mesuring cellular proliferation by MTT assay.Results: rhTRXδ3 shows a more potently cytoprotective activity against cytokine withdrawal-induced apoptosis and a growth-promoting effect than that of rhTRX in GM-CSF-dependent cell line TF-1 and G-CSF-dependent cell line NFS60.Conclusion: Recombinant hTRX and hTRXδ3, expressed in E.coli, possess varions bioactivities.

KEY WORDSThioredoxin/pharmacol; hTRXδ3; Apoptosis; Tumor cells, cultured/drug eff

（J Beijing Med Univ, 2000,32:328-331）

人硫氧还蛋白（human thioredoxin，hTRX）是一种硫氧化还原酶，与多种生物反应过程紧密相关，是一些细胞重要的生长调节因子^［1］。已证实成人T白血病细胞的自分泌生长因子——成人T细胞衍生因子（adult T-cell derived factor ,ADF）即为hTRX^［2］。在细胞内，hTRX调节细胞内信号分子、蛋白与蛋白、蛋白与核酸的相互作用，最终影响基因的表达^［3］。在DNA与糖皮质激素受体结合、铁反应性结合蛋白与转铁蛋白受体mRNA的相互作用中TRX都是必不可少的。TRX可通过调节Ref-1／APEX而增强Jun／Fos复合物与转录因子AP-1位点的结合，还调节转录因子NF-κB与它的Cis位点结合及与DNA结合。最近，发现细胞内TRX可抑制凋亡信号调节激酶I（apoptosis signal-regulating kinase 1, ASK1）和CASPASE-3样蛋白酶的活性而抑制细胞凋亡^［4，5］。TRX与2-含氧酸脱氢酶相互作用，不仅与TRX活性位点有关，还与活性区以外氨基酸残基的极性有关^［6］。

本室在构建hTRX表达克隆中，在国际上首次发现在人胎肝细胞中存在一种hTRXδ3——hTRX的不同剪切形式（GenBank登记号为AF065241）^［7］，它缺少hTRX的第3外显子，活性部位Trp-Cys-Gly-Pro-Cys仍然存在，其它编码区域序列没有改变。为了研究hTRXδ3与hTRX在功能上的区别，我们表达和纯化成功重组hTRXδ3蛋白，首次发现在依赖IL-3、GM-CSF生长的TF-1细胞（人红白血病细胞）和依赖G-CSF生长的NFS60细胞（小鼠白血病细胞）撤除细胞因子后，加入rhTRXδ3比加入rhTRX能更有效地抑制这两种细胞的凋亡并有促增殖的作用。

1材料与方法

1.1材料

菌株：大肠杆菌pop2136（C600衍生株，含CI857基因，编码温度敏感的λ阻遏蛋白）,由Raidaud博士惠赠。DH5αF'IQ^TM购自GIBCO-BRL公司。

质粒： pMT-hIL-3质粒由本室构建^［8］。pGEM-3zf(±)质粒和pUC19质粒购自Promega公司。

组织和细胞：TF-1(来自红白血病病人的前髓系细胞株)，NFS60细胞（小鼠白血病细胞）：本室常规培养。

试剂：各种限制性内切酶、DNA修饰酶、核苷酸dNTP、ATP购自Boehring Mannheim、GIBCO-BRL、Promega、华美、Stratagene等公司。DEAE-Fast Flow柱填料购自Pharmacia公司。测序样品处理试剂盒：Auto Cycle^TMSequencing Kit，购自Pharmacia公司。ANNEXIN V-FITC由本室提供。

1.2方法

pMT-hTRX和pMT-hTRXδ3原核表达质粒的构建：在获得的人胎肝PCR产物中加入Klenow酶30℃15 min以切去3′突起A，65℃灭活10 min，用Promega公司的Magic Minipres柱纯化PCR产物。然后将纯化的PCR产物用XbaI酶切，pMT-hIL-3质粒经HpaI、XbaI酶切，选用T4连接酶在14℃过夜连接。

核酸序列测定：将pMT-hTRX和pMT-hTRXδ3用EcoRI和XbaI酶切后释放的含有全部目的基因的片段克隆到pGEM-3zf(±)或pUC19质粒载体中，提取质粒用试剂盒Auto Cycle^TMSeguencing Kit处理质粒样品后，在ALF DNA自动序列分析仪上测序。

质粒转化、诱导及细菌裂解：按本室方法进行^［9］。

蛋白分离纯化：经凝血酶切的蛋白样品，上DEAE Fast Flow柱，收集NaCl梯度洗脱的各样品峰。

细胞增殖测定：在依赖IL-3、GM-CSF生长的TF-1细胞（人红白血病细胞）和依赖G-CSF生长的NFS60细胞（小鼠白血病细胞）的培养基中，撤除细胞因子后，加入rhTRXδ3和rhTRX蛋白，48～72h后，加MTT，4～6h后加入裂解液，12～24h后用酶联免疫检测仪测定540 nm吸光度(D_540nm)，以不加因子细胞孔作为空白对照。

细胞凋亡检测：在依赖IL-3、GM-CSF生长的TF-1细胞（人红白血病细胞）和依赖G-CSF生长的NFS60细胞（小鼠白血病细胞）的培养基中，撤除细胞因子后，加入rhTRXδ3和rhTRX蛋白，18 h后，用PBS洗细胞1次，用200 μl Binding Buffer悬起，加入ANNEXIN V-FITC（终质量浓度1 mg^．L^-1）、PI（终质量浓度2.5mg^．L^-1），室温避光保存15min，用流式细胞仪进行检测。

2结果

2.1原核表达质粒pMT-hTRX和pMT-hTRXδ3的构建

将人胎肝RT-PCR产物用XbaI酶切与pMT-hIL-3质粒HpaI、XbaI酶切产物连接，转化pop2136菌，涂LA板，37℃过夜。挑细菌克隆，经30℃增菌，42℃诱导表达后，125g^．L^-1SDS-PAGE分析，筛选出两种不同蛋白相对分子质量的阳性克隆。这两种克隆的质粒分别经StyI、PstI、VspI酶切，10g^．L^-1琼脂糖凝胶电泳分析鉴定，与理论计算的酶切片段大小相符。同时，我们以构建的质粒为模板进行PCR，经80g^．L^-1丙烯酰胺凝胶电泳鉴定为带目的基因的目的克隆。因此，初步确定，我们获得了pMT-hTRX和pMT-hTRXδ3原核表达质粒。

2.2核酸序列分析

测序结果与文献［2,10］报道的hTRX cDNA序列比较，核酸序列完全无误，证明我们同时获得了pMT-hTRXδ3和pMT-hTRX 两种表达克隆。

2.3大肠杆菌中原核表达蛋白的分析

150 g^．L^-1SDS-PAGE结果表明，pMT-hTRX克隆表达约25000左右的融合蛋白，经超声裂解细菌后，超声上清中含有可溶性的pMT-hTRX表达蛋白。pMT-hTRXδ3克隆表达约23000左右的融合蛋白，以包涵体形式存在，其超声上清中无可溶性的pMT-hTRXδ3表达蛋白。pMT-hTRX表达的融合蛋白MS2-hTRX和pMT-hTRXδ3表达的融合蛋白MS2-hTRXδ3经凝血酶消化，切下MS2，再经DEAE Fast Flow柱分离，得到纯化的蛋白（图1），纯度达95%，并用于活性测定。

1, negative control of E.coli lysate; 2, rhTRX expressed in E.coli;

3, sonic super