［摘要］ 目的：探讨非造血系统来源的恶性肿瘤细胞内Ig样蛋白与Ig分子在抗原性及分子结构上的关系。方法:应用亲和层析的方法将HeLa MR（人宫颈癌传代细胞）细胞内Ig样蛋白进行了纯化；并以SDS-PAGE及Western Blot方法将Ig样蛋白与IgG进行比较分析。结果:SDS-PAGE结果显示Ig样蛋白既有与IgG相近的轻、重链泳带，同时又分别在相对分子质量6600、7000左右出现两条泳带,此两条泳带与人IgG具有高度一致的抗原性。Western Blot结果显示，Ig样蛋白与IgG相同，不但可与抗人IgG多克隆抗体、单克隆抗体反应而且可与Protein A蛋白发生反应。结论：Ig样蛋白与IgG比较在抗原性上具有明显的一致性，而在分子结构上也表现明显相似性，但二者不完全相同。

［中图分类号］ R737.33［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0310-03

Purification and Western -blot analysis of Ig-like protein

from cervical cancer cell line

WANG Dong-Sheng

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

QIU Xiao-Yan

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

ZHU Xiao-Hui

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

LU Peng

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

JIANG Nan

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

LV Ping

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

ZHANG Ling

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

ZHANG Yan

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

GAO Xiao-Ming

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083, China)

ABSTRACTObjective: To characterise the Ig-like protein in non-hematopietic tumor cell lines.Methods: Western-blot and affinity chromatography methods were used to purify and analyze the proteins in cytoplasm of tumor cell lines. The Ig-like protein was purified by affinity chromatography using staphylococal protein G and goat anti-human IgG column.Results: SDS-PAGE indicated that Ig-like protein had not only the counterpart of the IgG heavy and light chain but also some specific bands molecular weight of 4 500, 6 600, 7 000. Western Blot analysis indicated that all the bands especially the 6 600 and 7 000 bands could react to anti-human IgG polyantibodies, anti-human IgG Mab and protein A.Conclusion: Protein purified by affinity chromatography showed high likeness with Ig protein. A conclusion can be drawn that Ig-like protein did exist in non-hematopietic tumor cell line.

KEY WORDSHeLa cells; Ig-like protein; IgG; Cervix neoplasms; Molecular structure

(J Beijing Med Univ, 2000,32：310－312)

在前期工作中，我们发现在多种上皮性肿瘤细胞内存在一种与Ig抗原性相同的物质^［1～3］，为了探讨这种Ig样物质在结构上是否与Ig相同，还是与Ig具有相同抗原性的另一种物质。我们首先筛选出一个Ig样蛋白高表达的上皮性肿瘤传代细胞系HeLa MR，对其大量培养后，提取、纯化其Ig样蛋白，并将其同IgG进行比较分析。

1材料与方法

1.1材料

HeLa MR为本实验室传代培养细胞；Protein G-Sepharose4B 购自Pharmacia公司；羊抗人IgG（解放军农牧大学赠送；血清双扩散效价1∶128）Sepharose 4B购自SIGMA公司；羊抗人IgG-HRP、Protein A-HRP、 羊抗鼠-HRP购自Pharmacia公司。 抗人IgG重、轻链单克隆抗体购自北京邦定公司；羊抗人IgG-Sepharose4B亲和层析柱由本室制备。BSA购自SIGMA公司。

1．2方法

细胞培养: HeLa MR肿瘤传代细胞培养于含10%(体积分数)小牛血清的DMEM培养基，5%(体积分数)CO₂、37℃培养。

HeLa MR胞浆蛋白的提取及Ig样蛋白的纯化：收集6×10⁸～8×10⁸细胞，以0.1mol^．L^－1 PBS洗两遍，以三去污缓冲液裂解法于冰浴中30min裂解细胞、释放胞浆蛋白，15000×g、于4℃离心30min，取上清，测蛋白浓度后进行纯化。Ig样蛋白的纯化按常规方法。

SDS－PAGE及Western Blot分析：以IgG做为阳性对照，将各样品用100 g^．L^－1的聚丙烯酰胺凝胶进行不连续的SDS－PAGE，然后进行考马斯亮蓝染色；或在SDS－PAGE 后，用电转移系统于电压100 V，在1.5 h内将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，经1%(质量分数)BSA封闭1 h后分别用羊抗人IgG-HRP、Protein A-HRP进行直接法染色；用抗人IgG重，轻链单克隆抗体做为一抗、羊抗鼠-HRP作为二抗进行间接法染色。即用Western-blot方法对Ig样蛋白与人IgG进行比较分析。

2结果

亲和层析纯化Ig样蛋白的结果：以羊抗人IgG-Sepharose 4B亲和层析柱及Protein G-Sepharose4B亲和层析柱纯化HeLa MR Ig样蛋白，在以甘氨酸缓冲液洗脱时发现，两种亲和柱都在洗脱约5 min，pH降至5.0左右时出现一个较明显的蛋白吸收峰（图 1）。

图1Protein-G蛋白层析柱纯化蛋白的吸收光谱(280 nm)

Figure 1Absorption spectrum of purified protein

from protein-G column

SDS-PAGE分析结果：纯化后的蛋白经SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色发现，Ig样蛋白既有与IgG重链（5 500）、轻链（2 500）相对分子质量相似的两条泳带，也有相对分子质量在4 500、6 600及7 000左右的3条泳带。未变性样品与人IgG未变性样品在相同位置出现条带。Western Blot分析表明：(1)羊抗人IgG-HRP染色发现，与IgG分子比较，Ig样蛋白样品除在5 500、2 500位置上与IgG一样出现阳性反应外，在相对分子质量4 500、6 600和7 000左右的位置均发生阳性反应（图2）；（2）Protein A-HRP检测发现，Ig样蛋白与IgG一样，只在部分尚存的完整IgG 分子位置出现明显的阳性信号，而轻、重链位置均未见阳性反应（图3）；（3）以抗人IgG轻、重链单克隆抗体进行间接法检测，则可在相对分子质量2 500、6 600、9 000左右出现清楚的阳性泳带（图4）。用Non-denature聚丙烯酰胺电泳后转膜，进行Western Blot检验，其反应特性与IgG高度一致（图5）。

1,2,3,4, purified protein from protein-G column; 5, human IgG.

图2Westem-blot以HRP标记羊抗人IgG多抗染色

Figure 2Western-blot stained with HRP labeled goat anti human IgG

1, human IgG; 2,3, purified protein from protein-G column;

4, rotein purified with goat anti human IgG.

图3Western-blot以HRP-SPA染色

Figure 3Western-blot stained with HRP-SPA

1, purified protein from protein-G column; 2, human IgG.

图4Western-blot以抗人IgG单抗为第一抗体，

以HRP标记羊抗鼠IgG为第二抗体进行间接法染色

Figure 4Western-blot use anti human IgG Mab as the first

antibody and stained with HRP labeled goat

anti mice IgG as the second antib