［摘要］ 目的：了解凋亡相关新基因TFAR19编码蛋白分子中潜在的Ser¹⁰⁰磷酸化位点与其促凋亡效应的关系。方法：利用重叠延伸PCR定点突变技术构建TFAR19 Ser¹⁰⁰→Ala¹⁰⁰突变体，用DNA测序技术验证，大肠杆菌表达，离子交换技术纯化重组突变蛋白，将其加入培养的白血病细胞株HL-60，通过PI染色，流式细胞仪分析，观察突变重组蛋白的促凋亡效应。结果：构建成TFAR19 Ala¹⁰⁰突变体，并经DNA测序所证实，在大肠杆菌中获得了高水平表达，Western blot表明突变型重组蛋白与野生型具有相同的免疫学活性，流式细胞仪分析发现突变蛋白对撤除血清的HL-60细胞具有与野生蛋白相似的剂量依赖性促凋亡效应。 结论：TFAR19 分子中潜在的Ser¹⁰⁰磷酸化位点对其促凋亡效应无影响，提示TFAR19发挥其生物学活性时无需cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶活化。

［中图分类号］ Q343.13［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0306-04

Site-directed mutagenesis of human TFAR19 and its expression,

purification and functional analysis

CAO Zhi-Min

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

ZHANG Ying-Mei

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

CHEN Ying-Yu

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

MA Da-Long

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

ABSTRACTObjective: To explore the relation between the potential phosphorylation site Ser¹⁰⁰ in the novel apoptosis-related molecule TFAR19 and the apoptosis-accelerating effect of the TFAR19 protein.Methods: Site-directed mutagenesis was used to create TFAR19 Ser¹⁰⁰→Ala¹⁰⁰ mutant. The mutant was expressed in E.coli and the recombinant protein purified by ion exchange chromatography. Cell apoptosis was analyzed by PI labeled FACS assay.Results: High level expression of TFAR19 Ala¹⁰⁰ mutant protein was achieved in E.coli. The mutant TFAR19 was demonstrated by western blot using mAb against TFAR19. The purified mutant TFAR19's apoptosis-accelerating effect on HL-60 cells induced by serum deprivation was dose-dependent, comparable to the wild type TFAR19.Conclusion: The potential phosphorylation site Ser¹⁰⁰ in the TFAR19 protein does not play an important role in its apoptosis-accelerating effect, implying that TFAR19 does not rely on cAMP and cGMP-dependent protein kinase's activation for its biological function.

KEY WORDSTFAR19; Point mutation; Apoptosis; Oxidative phosphorylation; Recombinant proteins/metab

(J Beijing Med Univ, 2000,32:306-309)

TFAR19基因（TF-1 cell apoptosis related gene）是本研究组利用cDNA-RDA技术从人红白血病细胞株TF-1细胞中克隆到的凋亡相关新基因之一（GenBank登记号AF014955）^［1，2］。研究发现该基因的表达产物具有抑制肿瘤生长和促进凋亡作用。计算机结构分析表明，TFAR19 蛋白分子中的Ser¹⁰⁰为可能的cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶的磷酸化位点^［3］。为了解该潜在的磷酸化位点与TFAR19分子促凋亡效应的关系，进而了解TFAR19的作用途径与可能的作用机制，本研究对该位点进行了定点突变，并对重组TFAR19 突变体进行了原核表达、纯化与初步的功能分析。

1材料与方法

1.1材料

pMTY4-TFAR19质粒为本室构建^［2，3］，含PL启动子，可在大肠杆菌表达MS2-凝血酶接头-TFAR19融合蛋白，经凝血酶切割可收获非融合的重组TFAR19蛋白。pGEM-T easy质粒购自Promega 公司。大肠杆菌pop2136（CI857温度敏感）为C600衍生菌，编码温度敏感λ阻遏蛋白，由Raiband博士馈赠。HL-60细胞株为人早幼粒细胞系，本室保存。抗TFAR19单抗为本室自制。HRP标记的羊抗鼠IgG购自Promega 公司。BioTrace PVDF杂交膜购自Gelman Science公司; Supersignal Western Blotting化学发光底物购自Pierce 公司。

1.2PCR 引物

TFAR19 编码区上游引物从起始密码子下游第一个氨基酸编码序列开始，序列为5′-GCG GAC GAG GAG CTT GAG GC-3′；下游引物含终止密码子和HindⅢ酶切点, 序列为5′-G CGA AGC TTA ATA ATC GTC ATC TTC ATC AG-3′。突变引物中含有定点突变氨基酸Ala(GCC)的编码序列，其上、下游引物序列彼此重叠且互补，分别为5′-C CTT AAA AAA GTA GCC CAA CAA ACA G-3′与5′-C TGT TTG TTG GGC TAC TTT TTT AAG G-3′。这些引物均由GIBCO BRL 公司合成。

1.3TFAR19 Ser¹⁰⁰→Ala¹⁰⁰的定点突变

按照文献记载的重叠延伸PCR法进行^［4］。先分别用编码区上游引物与突变下游引物；突变上游引物与编码区下游引物进行第1次PCR。然后将纯化后的两管PCR产物混合，再用编码区上、下游引物进行第2次PCR。纯化PCR产物，直接克隆到pGEM-T easy质粒中进行测序。

1.4DNA序列分析

用Amersham Pharmacia Biotech公司的ALF express II自动DNA测序仪，在本实验室进行TFAR19 定点突变产物的DNA序列测定。

1.5TFAR19突变体原核表达质粒pMTY4-mTFAR19的构建

用BamH I与Hind III双酶消化,从测序后的pGEM-mTFAR19质粒中将TFAR19突变cDNA片段切下，与经同样双酶消化的pMTY4-TFAR19质粒大片段进行置换亚克隆，得到定点突变的TFAR19原核表达质粒pMTY4-mTFAR19。

1.6重组TFAR19突变蛋白在原核细胞中表达和纯化^［5］

pMTY4-mTFAR19可在pop2136菌株中以包涵体的形式经42℃诱导表达融合蛋白。离心收集细菌，经超声裂解洗涤制备成包涵体。在8 mol^．L^－1尿素，20mmol^．L^－1 Glysine-NaOH (pH 10.0)中，37℃变性30min，再将变性液稀释至尿素为1mol^．L^－1进行复性，以HAc/ NaAc(pH 4.5)调复性液pH为8.5，加凝血酶27℃孵育过夜，利用DEAE离子交换层析进行蛋白质纯化，20mmol^．L^－1 Glysine-NaOH/HAc NaAc pH 8.5条件下上样，50mmol^．L^－1 Tris-HCl (pH 8.9) NaCl梯度洗脱，在0.06mol^．L^－1 NaCl洗脱下目的蛋白，SDS-PAGE分析重组突变蛋白的表达和纯度。野生型蛋白的纯化方法与之相同。

1.7重组TFAR19突变蛋白的Western blot

将纯化的TFAR19突变蛋白与野生型蛋白进行150 g^．L^－1 SDS-PAGE电泳，按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到BioTrace PVDF膜上。经50g^．L^－1脱脂奶粉封闭后，依次加抗TFAR19单抗（一抗），HRP标记的羊抗鼠IgG（二抗），最后用Supersignal Western Blotting 化学发光底物进行显影，观察结果。每步反应结束均用TBS-T(0.05mol^．L^－1 Tris-HCl pH 7.5, 0.15mol^．L^－1 NaCl, lml^．L^－1 Tween-20)洗涤3次，每次15min。

1.8重组TFAR19突变蛋白对HL-60细胞促凋亡效应的检测

HL-60细胞在含100 ml^．L^－1小牛血清RPMI/1640培养液中培养2 d后，离心收集细胞，用无血清1640洗涤细胞2次，以无血清1640调整细胞浓度为1.2×10⁶ml^－1，放入24孔培养板中，实验孔分别加入纯化的mTFAR19蛋白15、7.5、3.75μg及突变与野生蛋白各7.5 μg，野生型对照孔加入重组TFAR19蛋白15 μg，阴性对照孔加入与其实验孔等体积的PBS，放入37℃培养箱5%（体积分数）CO₂，16 h后收获，对凋亡细胞进行检测。

1.9凋亡细胞DNA含量的流式细胞仪分析

将突变型及野生型TFAR19蛋白处理过的HL-60细胞经PBS洗涤2次，溶于PBS中加入RNAse（10g^．L^－1）5μl，37℃作用30 min，加入（10g^．L^－1）碘化丙啶（propidium iodide, PI）10μl。用流式细胞仪测定细胞DNA结合PI的荧光强度，在DNA的荧光直方图中，分析前向角散射光强度和侧向散射光强度，以确定凋亡