［摘要］ 目的：观察去甲肾上腺素在体外诱导正常大鼠淋巴细胞产生应激免疫抑制蛋白。方法：采用体外培养的方法，以ConA活化正常大鼠的淋巴结细胞，同时加入去甲肾上腺素共同孵育12～16h，测定细胞提取物对正常小鼠淋巴细胞转化的影响。并利用应激免疫抑制蛋白单克隆抗体以抗体中和及ELISA法，鉴定应激免疫抑制蛋白。结果：去甲肾上腺素（10^－5～10^－3 mol·L^－1）可在体外诱导以ConA活化的淋巴细胞产生一种能抑制正常淋巴细胞转化的物质。用应激免疫抑制蛋白单克隆抗体所作的抗体中和及ELISA测定发现，提取物中的抑制物可被应激免疫抑制蛋白单克隆抗体识别。结论：去甲肾上腺素可以在体外诱导ConA活化的淋巴细胞产生应激免疫抑制蛋白。

［中图分类号］ R967［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0334-03

A cellular model for generation of immunosuppressive protein

induced by norepinephrine

SHAO Li

(Department of Physiology, Peking University, Beijing100083， China)

CHEN Guo-Li

(Department of Physiology, Peking University, Beijing100083， China)

LI Ju-Xiang

(Department of Physiology, Peking University, Beijing100083， China)

SUN A-Ping

(Department of Physiology, Peking University, Beijing100083， China)

FAN Shao-Guang

(Department of Physiology, Peking University, Beijing100083， China)

ABSTRACTObjective: To establish a cellular model for generation of immunosuppressive protein induced by norepinephrine from normal lymphocytes in vitro.Methods: Normal lymphocytes activated by Con A were incubated with norepinephrine. Extract of lymphocyte was made after the incubation and the effect on normal lymphocyte proliferation was tested. Monoclonal antibody against immunosuppressive protein was used to identify the extract.Results: Lymphocyte proliferation in response to ConA was significantly suppressed by the extract. The suppression induced by the extract was partially reversed by the monoclonal antibody against immunosuppressive protein . ELISA results showed that there were molecules in the extract, which were combined by the monoclonal antibody.Conclusion: Immunosuppressive protein could be induced by norepinephrine from ConA activated lymphocytes.

KEY WORDSStress immunosuppressive protein; Lymphocytes/secret; Norepinephrine/pharmacol

(J Beijing Med Univ, 2000,32:334-336)

我们以前的工作表明，束缚应激后的大鼠或小鼠血清中出现的一种称为应激免疫抑制蛋白的大分子蛋白质能抑制正常T、B淋巴细胞分别由ConA和LPS诱导的转化等免疫反应。应激免疫抑制蛋白是在中枢神经系统的控制下，由淋巴细胞产生后释放到血液中的^［1］。为进一步研究应激状态下神经系统对应激免疫抑制蛋白生成的调控机制，我们应用6-羟多巴胺（6-OHDA）作腹腔注射，化学性切除大鼠或小鼠的交感神经末梢。结果表明大鼠或小鼠应激后淋巴细胞产生的应激免疫抑制蛋白明显减少，说明交感神经在应激免疫抑制蛋白的产生中起有重要作用^［2］。本研究证明在体外去甲肾上腺素可以诱导淋巴细胞产生应激免疫抑制蛋白。

1材料与方法

1.1材料SD雄性大鼠，体重180～220g；BALB/C雄性小鼠，体重20～25g，均由我校实验动物科学部提供。去甲肾上腺素、刀豆蛋白A （ConA）均购自美国Sigma公司。细胞培养液RPMI1640为GIBCO 公司产品。胸腺嘧啶核苷(³H-TdR)为北京原子能研究所产品。

1.2方法

1.2.1体外诱导生成应激免疫抑制蛋白正常SD大鼠颈脱臼处死，无菌条件下取肠系膜淋巴结，以完全RPMI 1640制成单个淋巴细胞悬液 。取24孔细胞培养板，每孔细胞数为5×10⁶，去甲肾上腺素浓度分别为0、10^－7、10^－5、10^－3 mol·L^－1, ConA为2.0、4.0、8.0 mg·L^－1，总体积为1ml。在37℃孵育12 h后收集细胞。孵育后的细胞每5×10⁶个以等渗磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次体积6 ml。风干剩余液体后加0.05 mol·L^－1的盐酸1 ml在冰浴中匀浆，离心2 300×g，30min，去沉淀，上清液冷冻干燥后以不完全RPMI1640复溶，按一定比例加入正常小鼠淋巴细胞悬液，观察其对淋巴细胞转化的影响。

1.2.2ConA诱导的淋巴细胞转化取正常BALB/C 雄性小鼠颈脱臼处死，在无菌条件下取出肠系膜淋巴结，以完全RPMI 1640制成单个淋巴细胞悬液 。取96孔细胞培养板，每孔细胞数为3×10⁵，ConA为每孔0.40 μg，按一定比例加入细胞提取物，总体积为200 μl，每种细胞提取物的浓度设三复孔。细胞在37℃，95%(体积分数)的空气，5%(体积分数)CO₂的条件下孵育42h后，每孔加³H-TdR 7.4kBq继续孵育6 h，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用β-液体计数仪测定放射性活度，以Bq作单位。

1.2.3应激免疫抑制蛋白单克隆的对抗作用

不同质量浓度的应激免疫抑制蛋白单克隆抗体（0.0015、 0.003 g·L^－1，抗体由我室制备^［3］）与细胞提取物按1∶8体积的比例及培养液RPMI 1640混合（每孔100 μl），在CO₂孵育箱内孵育2h后。每孔加入正常淋巴细胞悬液100μl（含细胞3×10⁵个，ConA 0.4μg），培养，收获细胞及测定放射活性（方法同上）。观察应激免疫抑制蛋白单克隆抗体对去甲肾上腺素诱导的细胞提取物抑制活性的影响。

1.2.4ELISA 法测定应激免疫抑制蛋白单克隆抗体与细胞提取物的结合

将细胞提取物分别超滤去除相对分子质量小于30 000的物质，按10 mg·L^－1的蛋白含量溶于pH 9.5的碳酸盐缓冲液，以100μl/孔包被酶标板，4℃过夜。次日弃上清。以含20 g·L^－1牛血清白蛋白的等渗磷酸盐缓冲液37℃封闭2h。用含0.05%(体积分数)Tween 20的0.01 mol·L^－1、pH7.0的磷酸盐缓冲液洗3次（以下洗涤液同此）。每孔加应激免疫抑制蛋白的单克隆抗体0.03μg，在37℃反应2h。再用上述液体洗3次。每孔加羊抗小鼠的IgG(体积分数1∶1000)100 μl, 37℃孵育2 h，仍用上述液体洗3次后每孔加底物OPD 0.04 mg，室温避光反应30 min，最后每孔加1 mol·L^－1硫酸100 μl终止反应，用96孔酶标仪在波长492nm处测光密度(D)。

1.2.5数据处理与统计学方法文中数据以±s差表示，两两比较用t检验，多组数据间以ANOVA分析。P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.1去甲肾上腺素诱导产生淋巴细胞转化抑制物

正常大鼠淋巴细胞在体外与去甲肾上腺素（10^－5、10^－3 mol·L^－1）和ConA (4.0mg·L^－1）共同孵育12h后，细胞提取物作用下的淋巴细胞转化与去甲肾上腺素浓度为0时相比，差异有显著性(n=6,P＜0.05，ANOVA，图1)。

图1去甲肾上腺素在体外诱导活化的

淋巴细胞产生抑制淋巴细胞转化的物质

Figure 1Effect of extract from lymphocyte after incubated

with norepinephrine on the lymphocyte proliferation

2.2不同浓度ConA活化淋巴细胞对去甲肾上腺素作用的影响

在去甲肾上腺素浓度不变（10^－3mol·L^－1）的条件下，ConA为2.0、4.0、8.0mg·L^－1时，孵育后细胞提取物对淋巴细胞转化的影响与ConA浓度为0时相比，ConA为2.0、4.0、 8.0mg·L^－1时淋巴细胞提取物都显著抑制正常淋巴细胞转化，并且随ConA浓度增加，抑制作用增强，提示T淋巴细胞的活化是产生淋巴细胞转化抑制物的必要条件（图2）。

图2T淋巴细胞的活化与去甲肾上腺素诱导淋巴

细胞转化