［摘要］ 目的：研究雷公藤多甙（tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides，TWG）对角朊细胞株(COLO-16)的增殖抑制及对凋亡的影响，并探讨其治疗免疫性皮肤病的机制。方法：MTT法检测细胞增殖抑制，二苯胺及PI染色法检测细胞凋亡，RT-PCR测细胞bcl-2及bcl-Xs mRNA表达。结果：TWG 0.25mg^.L^－1与角朊细胞共育72h后，角朊细胞增殖活性受抑，此抑制作用具药物(质量)浓度依赖性；TWG 1mg^.L^－1作用于角朊细胞72 h，即可使片段化DNA含量及亚二倍体细胞百分数较对照明显增加,此现象随药物质量浓度增加而增高;TWG 5mg^.L^－1，可上调角朊细胞bcl-Xs mRNA表达，此作用随药物作用时间延长而增强；TWG对bcl-2 mRNA表达则无明显影响。结论：TWG可抑制角朊细胞株增殖并诱导其凋亡，此诱导凋亡机制可能与bcl-Xs上调有关。

［中图分类号］ R986［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0343-04

Regulatory effects of Tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides

on inhibiting proliferation and inducing apoptosis of keratinocytic line

ZHANG Qian

(Department of Dermotology， Peking University Third Hospital,Beijing 100083, China)

CHEN Xue-Rong

(Department of Dermotology， Peking University Third Hospital,Beijing 100083, China)

BAI Xiao-Wei

(Department of Immunology, Peking University School of Basic Medical Sciences)

YIN Jin-Zhu

(Department of Immunology, Peking University School of Basic Medical Sciences)

ABSTRACTObjective: To investigate the effect of tripterygium wilfordii hook f multi-glycosides(TWG) on proliferation and apoptosis of COLO-16 cells.Methods: Cell proliferation was measured using the MTT method; apoptosis was determined by DNA fragmentation and PI staining for Flow Cytometry assay; RT-PCR was used to evaluate the expression of bcl-Xs and bcl-2 mRNA.Results: Treatment of COLO-16 cells with TWG resulted in (1) significant inhibition of proliferation in a dose-dependent manner, (2) The DNA fragmentation and hypodiploid cell formation, (3) Up-regulation of bcl-Xs mRNA.Conclusion: TWG induced apoptosis and inhibited the proliferation of COLO-16 cells. TWG might achieve this effect by up-regulation the bcl-X genes.

KEY WORDSTript wilf polyglycosidum/pharmacol; Keratinocytic； Apoptosis/drug eff; Proliferation

(J Beijing Med Univ, 2000,32:343-346)

雷公藤多甙作为一种免疫抑制剂，在皮肤科多用于结缔组织病及银屑病等与免疫相关的疾病治疗，雷公藤的提取物——雷公藤内酯醇已制成软膏外用治疗银屑病，并取得良好的疗效。至于雷公藤作用机制，研究较多的是其对外周血淋巴细胞的增殖抑制及抑制细胞因子的产生和分泌，如一些体外实验发现雷公藤制剂可抑制活化的人外周血T、B淋巴细胞增殖，降低IL-2、IL-4及Ig的产生^［1～4］;雷公藤内酯醇及T2能诱导活化T细胞及人肥大细胞白血病细胞系HMC-1凋亡^{［3，5，6］}。

研究表明，角朊细胞在维持皮肤免疫自稳中有重要作用^［7］，如果角朊细胞的增殖、分化及凋亡的平衡失调则可导致皮肤病。如常见的皮肤病——银屑病，作为一种免疫性疾病，其免疫发病机制可能为抗原呈递细胞将抗原呈递给表皮内的CD4 T细胞，启动疾病；活化的CD4 T细胞释放细胞因子，直接刺激角朊细胞增生及诱导角朊细胞活化并分泌细胞因子及表达粘附分子；然后角朊细胞通过自泌作用及与T细胞的细胞因子的旁泌作用，进一步促进角朊细胞不断增生，使此过程周而复始。

雷公藤制剂内服及外用治疗皮肤病时，除具有对活化的外周血淋巴细胞产生免疫抑制及诱导凋亡的作用，是否尚具有直接抑制角朊细胞增殖，并诱导其凋亡的作用机制，本文拟对此进行探讨。

1材料与方法

1.1药品

雷公藤多甙（TWG，湖南株洲制药三厂生产）由我校实验药厂从片剂中提取有效成分，DMSO助溶，⁶⁰Co照射灭菌，实验前用培养基分别配制成所需浓度。

1.2试剂及仪器

1.2.1试剂RPMI-1640培养基（GIBCO公司）；MTT（噻唑篮）及PI（碘化丙啶）（Sigma公司）；Trizol（RNA提取剂）（北京京师生物工程技术公司）；dNTPs，DTT，RNA酶抑制剂，AMV-RT及Taq酶（Promega公司）；二苯胺试剂（中国上海南翔试剂厂）；以下引物由美国Cybersyn公司合成。

人bcl-2引物（219bp）：

5′GGAACTGTACGGCCCCAGCATGCG3′

5′TGCAGCTTTGTTTCATGGTAGATC3′

人bcl-Xs引物（151bp）：

5′CGGGCATTCAGTGACCTGAC3′

5′TCAGGAACCAGCGGTTGAAG3′

人(-actin引物（548bp）：

5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′

5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′

1.2.2仪器450型ELISA-RADER仪（Bio-Rad公司），FACScan流式细胞计（美国Becto-Dickinson 公司），ThermojeT PCR仪（EquiBio公司），数字化凝胶成像分析仪（天津市帝格科技公司），DU-640（BECKMAN公司）。

1.3细胞株及细胞培养

角朊细胞株COLO16（我校免疫学系保存）培养于含10%(体积分数)灭活小牛血清的完全RPMI-1640培养基中；置5%（体积分数）CO₂孵箱，37℃。

1.4MTT法测细胞增殖^［8，9］

角朊细胞1×10⁵ ml^－1加96孔平板，每孔200μl，培养18～24 h，半量更换培养液后加药，以溶媒做对照，对照及终(质量)浓度为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10、50、100 mg^．L^－1的TWG各设三复孔，继续培养72h；实验结束前4h弃去培养液，加MTT，37℃继续孵育4 h，弃去MTT，加DMSO，室温振荡0.5 h，ELISA-RADER仪读取波长595 nm光密度（D）；D与活细胞数成正比。

1.5TWG对角朊细胞凋亡的影响

角朊细胞以每瓶1×10⁶，培养在50ml培养瓶中18～24h，更换培养液，每瓶10ml，同时加药并以其溶媒做对照。

细胞片段化DNA百分含量测定^［10］：对照及加入终(质量)浓度为1、2.5、5 mg^．L^－1的TWG，培养72h，消化细胞，加400μl细胞溶解液，4℃，30 min；离心13 000×g，10min；上清中含片段化DNA，沉淀为完整的高相对分子质量DNA。于200 μl沉淀及200μl上清中分别加入400μl二苯胺试剂30℃，20 h；取200 μl加96孔平底细胞培养板，用酶标仪测590 nm光吸收值（D）。片段化DNA百分含量=2×D_上清/（2×D_上清+D_沉淀）×100%

流式细胞仪分析亚二倍体细胞含量：对照及加入终(质量)浓度为1、2.5、5 mg^．L^-1的TWG加入，培养72h，消化细胞，离心1000×g，10 min，弃上清，悬于1 ml PI染液4℃过夜；上机前过200目尼龙网，去除细胞团块，然后上FACScan分析（10⁴细胞中）亚二倍体细胞含量。

RT-PCR方法测TWG作用后角朊细胞bcl-2及bcl-Xs mRNA表达：加入终(质量)浓度为5 mg^．L^－1的TWG，培养24、48、72h；0h为未加药正常对照。按Trizol试剂盒所示方法提取细胞总RNA，并在DU-640仪上测定RNA浓度，然后进行RT-PCR；实验中设无RNA成分阴性对照，设β-actin引物同步扩增；扩增产物用20 g^．L^－1琼脂糖凝胶（含0.5 mg^．L^－1EB）电泳，于紫外检测仪及数字化凝胶成像分析仪上观察并测电泳条带灰度值（IOD）作为半定量指标，用β-actin校准。

1.6统计

EXCEL软件做t检验。

2结果

2.1TWG对COLO-16细胞增殖抑制作用

TWG为0.1 mg^．L^－1时，其D高于对照（P＞0.05）；TWG质量浓度≥0.25 mg^．L^－1后，随TWG质量浓度增高，D降低，提示其抑制细胞增殖的能力随药物质量浓度增加而增加；TWG为0.25 m