［摘要］ 目的：建立药物诱导狼疮（drug-induced lupus, DIL）的动物模型，研究狼疮诱导药物对小鼠免疫功能的影响。方法：用普鲁卡因酰胺（procainamide, Pca）、盐酸肼苯哒嗪（hydralazine, Hyd）和2,2′-偶氮-双（3-乙苯基-噻唑啉-6-硫酸）诱导DIL的动物模型。用³H－TdR参人法分析细胞增殖，流式细胞分析法分析细胞表型。结果：Pca和Hyd能诱导BALB/C小鼠而不是C57BL/6小鼠产生抗核抗体。对用药BALB/C小鼠的免疫功能（包括对外来抗原的免疫应答、外周血中淋巴细胞的分型等）的分析发现其部分免疫功能的异常。结论：狼疮诱导药物能够导致BALB/C小鼠部分免疫功能的紊乱。

［中图分类号］ R979.5［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0316-04

Influence of lupus-induced drugs on immune functions of mice

KANG Zi-Zhen

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

LU Ping

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

ZHANGYan

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

ZHU Xiao-Hui

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

GUO Chang-Zhan

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

ZHANG Ling

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

GAO Xiao-Ming

(Department of Immunology, Peking University, Beijing100083， China)

ABSTRACTObjective: To investigate the mechanisms of drug-induced lupus in a mouse model.Methods: Procainamide(Pca), hydralazine(Hyd) and azino-bis(3-ethylbenz-thioline-6-sulfolic acid)(ABTS) were used to treat mice of different strains for up to 8 months. Serum anti-nuclear antibody levels were assesed by ELISA and immuno-fluorescence staining. Cell proliferation was measured by³H-TdR incorporation.Results: Pca and Hyd could induce production of anti-nuclear antibodies in BALB/C mice but not C57BL/6 mice. Assays of immune functions of drug-treated BALB/C mice found part of immune functions abnormal, including immune response to protein antigen, assays for phenotype of T and B cells from peripheral blood et al.Conclusion: Lupus-inducing drugs can induce functional changes of the immune function in BALB/C mice, leading to production of ANA.

KEY WORDSDrug-induced lupus; Antibodies anti-nuclear; Procainamide/pharmacol; Hydralazine/pharmacol

（J Beijing Med Univ, 2000,32:316-319）

已知至少有40多种药物由于长期使用而诱导患者产生红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）样症状，即药物诱导的狼疮（drug-induced lupus, DIL）。DIL具有停药后症状缓解或消失的特征，而且临床上DIL的诱发率较低，因此直接研究人DIL致病机制的材料和标本来源比较困难。建立DIL的动物模型不但有利于更深入地研究狼疮诱导药物对免疫系统功能的影响，而且对研究SLE等自身免疫病的致病机制具有重要意义。在狼疮诱导药物中普鲁卡因胺（procainamide, Pca）的危险性最大，治疗过的病人中约20％的发病率^［1］，而肼屈嗪(盐酸肼苯哒嗪，hydralazine, Hyd）次之，诱发率约10％^［2］。我们用Pca，Hyd和2,2′-偶氮-双（3-乙苯基－噻唑啉－6－硫酸 ）［azino-bis(3-ethylbenz-thioline-6-sulfolic acid), ABTS］ ABTS对BALB/C小鼠和C57BL/6小鼠进行了长时间的处理，并分析用药小鼠的免疫功能。

1材料与方法

1.1动物及其处理

BALB/C小鼠（H－2^d），C57BL/6（H－2^b）小鼠，两种品系小鼠均为雌性，开始试验年龄为6～8周。小鼠购于中国科学院遗传研究所。动物都在无病原体的环境下培养。BALB/C、C57BL/6小鼠各分成4组，每组12只，每一品系的小鼠设一对照组，注射生理盐水，其它各组分别用3种药物处理，药物质量浓度均为1g^．L^－1，每只每次腹腔注射1ml，每周3次。血清的制备采用眼眶取血。

1.2试剂

Pca、Hyd和ABTS购于Sigma公司，Saponin(佐剂)，胎牛血清（hyclone）,Click's培养基（gibco BRL）,绿色荧光蛋白［green fluorescent protein, GFP，本实验室自制，纯度(质量分数)在95％以上］，³H-TdR（北京原子能研究所）。卵清蛋白（ovalbumin,OVA） ，FITC标记的兔抗小鼠丙球(自制)，FITC标记的大鼠抗小鼠CD8抗体和PE标记的大鼠抗小鼠CD4抗体（殷金珠教授惠赠）。

1.3细胞的制备，培养与增殖分析

小鼠引颈处死后，取淋巴结细胞，制成终浓度为5×10⁶ ml^－1的细胞悬液。细胞用Click's培养基培养，培养基使用前补加5％(体积分数)胎牛血清，2mmol^．L^－1谷氨酰胺，100u^．ml^－1青霉素，100mg^．L^－1链霉素和5×10^－5mol^．L^－1二巯基乙醇。细胞于96孔板培养，每孔加200μl培养基和5×10⁵个细胞，每个样品设3个平行孔。做T细胞的OVA特异性分析时每孔加终(质量)浓度100g^．L^－1的OVA。细胞培养72h，收集前6 h参入³H-TdR，每孔参入3700 Bq³H-TdR，^3H-TdR的参入率用液闪仪（Wallac）检测。刺激指数为加抗原时的³H-TdR参入值与不加抗原时的³H-TdR参入值的比。

1.4动物的免疫与抗体检测

动物的免疫采用腹腔免疫法，用GFP作抗原，每次每只小鼠注射0.5 ml，含100 μg抗原和50 μg的Saponin(佐剂)，第2周以同样的剂量加强一次，10 d后，眼眶取血，制血清。抗体的检测用ELISA法，用质量浓度为10 mg^．L^－1的GFP包被酶标板，血清按体积比1∶100 000稀释，以未免疫的正常BALB/C小鼠的血清作阴性对照，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG。每个样品的检测设3个平行孔，吸光度（absorbance, A）用酶标仪(Bio-Rad)读数，波长为490nm。免疫BALB/C小鼠取淋巴结时，采用尾根部皮下免疫OVA的方法，每只免疫100μg OVA和50μg佐剂，总体积100μl，7d后取腹股沟和主动脉旁淋巴结细胞。

1.5间接免疫荧光法检测抗核抗体^［3］

Hep-2细胞于6孔板培养好后，用PBS洗两遍，然后用80％(体积分数)的甲醇固定10 min，洗两遍。加一抗，反应45 min，PBS洗3遍。加FITC标记的兔抗小鼠丙种球蛋白，反应30 min，洗3遍。荧光显微镜（Leica DM LB）下观察。血清和二抗都用含10％（体积分数）小牛血清的PBS稀释，小鼠血清均按体积比1∶20稀释，为对应实验组的混合血清。以5～6个月的BXSB雄性小鼠的混合血清为阳性对照，以正常BALB/C小鼠混合血清为阴性对照。

1.6小鼠外周血中的T、B细胞的流式细胞分析（FACS）

T细胞亚类的分析：从小鼠眼眶取血，用肝素抗凝。每只Eppendorf管中加新鲜血液200 μl，离心，去血清。每管各加50 μl FITC标记的大鼠抗小鼠CD8抗体和PE标记的大鼠抗小鼠CD4抗体（按体积比1∶10稀释），以不加抗体作为阴性对照。40℃孵育30 min，PBS洗2遍。加红细胞溶解液，PBS洗3遍。离心，去上清，每管加1 ml FACS 细胞保存液。流式细胞计（becton dikinson,USA）上分析细胞表型。用Lysis Ⅱ统计软件分析数据。

B细胞的分析：实验步骤同T细胞的流式细胞分析。抗体用FITC标计的兔抗小鼠Ig（按体积比1∶20稀释）。

1.7统计学分析

实验结果用±s表示，实验组与对照组差异性的比较采用t检测法。

2结果

2.1药物诱导BALB/C小鼠抗核抗体的产生

为了探明遗传因素对DIL动物模型的影响，我们用纯系的BALB/C小鼠（自身免疫病易感）和C57BL/6小鼠（自身免疫病抗性）进行药物诱导抗核抗体的实验。用药8个月后，每个试验组的12只小鼠的血清混合在一起，以正常BALB/C小鼠的混合血清为阴性对照，以5～6个月雄性BXSB小鼠的混合血清为阳性对