［摘要］ 目的：构建抗卵巢癌单链抗体183B₂ScFv 与假单孢外毒素（peudononas exotoxin, PE38）的融合蛋白表达载体并制备抗人卵巢癌单链免疫毒素蛋白183B₂ScFvPE38，为卵巢癌导向治疗打下基础。方法：采用基因工程技术，经过3次亚克隆，将编码单链抗体的基因及编码毒素的基因亚克隆至原核表达载体pET30a（+）上，并在IPTG的诱导下进行表达。采用直接ELISA及细胞杀伤对抗体及毒素部分的活性进行检查。结果：表达蛋白183B₂ScFvPE38具有较好的抗体活性及毒素活性。结论：抗卵巢癌单链免疫毒素183B₂ScFvPE38 具有良好的免疫学活性及生物学活性，可能有良好的应用前景。

［中图分类号］ R966［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0347-04

Vector construction and high level expression of single chain

immunotoxin against ovarian carcinoma

YOU Fang-Lei

(Department of Gynecologic Oncology, Peking University People's Hospital,Beijing100044, China)

FENG Jie

(Department of Gynecologic Oncology, Peking University People's Hospital,Beijing100044, China)

CHEN Ye-Xia

(Department of Gynecologic Oncology, Peking University People's Hospital,Beijing100044, China)

QIAN He-Nian

(Department of Gynecologic Oncology, Peking University People's Hospital,Beijing100044, China)

ZHOU Ping

(Department of Gynecologic Oncology, Peking University People's Hospital,Beijing100044, China)

YE Xue

(Department of Gynecologic Oncology, Peking University People's Hospital,Beijing100044, China)

ABSTRACTObjective: To construct an expression vector for co_expression of single chain Fv antibody (OC183B₂) and peudomonas exotoxin(PE38).Methods: Clone the genes of ScFv (OC183B₂) and PE38 into PET30a(+) and then express the immunotoxin after induced with IPTG.Results: Liable activity of antibody and toxic in were both observed in the fusion recombinant protein.Conclusion: The recombinant fusion protein 183B₂ScFvPE38 keeps the activity of both components and may be of great use in the future to deal with ovarian carcinoma.

KEY WORDSAntibodies, neoplasm; Immunotoxins; Drug carriers/metab; Ovarian neoplasms; Recombinant fusion proteins/metab

(J Beijing Med Univ, 2000,32:347-350)

近年来，随着分子生物学及免疫学技术的发展，肿瘤的生物学治疗已经成为除手术治疗、放疗、化疗之外重要的治疗方式。我室多年来一直从事以单克隆抗体为载体，荷载同位素、药物、毒素蛋白等,对卵巢癌进行免疫导向诊断和免疫导向治疗的研究，现已成功制备了小分子单抗^［1］，经⁹⁹mTc标记下进行裸鼠荷瘤模型放射免疫显像的研究，并获得了清晰的图象。在此基础上，本实验意在应用本室制备的单链抗体构建免疫毒素，研究在抗体导向下，携带毒素蛋白对卵巢癌进行靶向治疗的可能性。

免疫毒素是肿瘤生物治疗的一种新方法。在国外，部分免疫毒素已进入Ⅰ期及Ⅱ期临床实验研究阶段。实验证实免疫毒素具有良好的应用前景^［2，3］。但在国外卵巢癌特异性单克隆抗体构建免疫毒素的研究报道还很少见,国内未见有关报道。

1材料与方法

1.1载体构建及免疫毒素的高效表达

1.1.1质粒和菌株pET16-183B₂ ScFv为本室构建的含有183B₂单链抗体基因(183B₂ScFv)的质粒， PAGIT为含有毒素基因(peudononas exotoxin, PE38)的质粒。高效表达质粒pET30a（+），质粒pUC18，大肠杆菌Bl21，DH5α为本室保存。质粒PAGIT及菌株GI724 为中国科学院遗传研究所黄华梁教授赠送。

1.1.2限制性内切酶和工具酶购自Promega公司。细胞系：卵巢癌细胞系SKOV₃，宫颈癌细胞系HeLa 为本室保存。

1.1.3免疫毒素表达载体的构建(图1)(1) pUC18-183B₂ScFv的构建： pET16-183B₂ScFv用NdeⅠ，EcoRⅠ消化，以切下单链抗体，并回收小片段；pUC18以相同位点酶切，回收大片段。在T₄ DNA 连接酶的作用下将单链抗体亚克隆至pUC18中，并称之为pUC18-183B₂ScFv。(2) pUC18-ScFvPE38的构建：将质粒pUC18-183B₂ScFv用SacⅠ，EcoRⅠ消化，回收大片段；毒素PE38自PAGIT中由相同位点切下，回收并定向亚克隆至已回收的大片段中。此时所得质粒被命名为pUC18-ScFvPE38。(3) pET30-ScFvPE38的构建：pUC18-ScFvPE38 NdeⅠ，EcoRⅠ酶切下含有免疫毒素的片段，再以相同位点亚克隆至pET30a(+)中，完成高效表达载体pET30-ScFvPE38的构建。并对该质粒进行酶切鉴定。

图1载体构建图示

Figure 1Construction route of the vectors

1.1.4重组质粒的诱导表达、包涵体裂解及蛋白复性将含有重组质粒的Bl21大肠杆菌在37℃活化，1∶100(体积比)转接后继续培养至600 nm光密度约为0.4时，加IPTG至终浓度为0.4 mmol^．L^－1，诱导4h后收集菌体，超声破碎细菌，离心分离包涵体，并保留上清液。上清液用PBS透析过夜。包涵体经反复洗涤后，8mol^．L^－1尿素溶解，加入复性液（成分：50mmol^．L^－1 Tris-HCl,5mmol^．L^－1 EDTA,1mmol^．L^－1 氧化型谷光甘肽，5mmol^．L^－1 还原型谷光甘肽）稀释复性，10℃复性48h。PEG 20000浓缩后，对20mmol^．L^－1的Tris-Cl及不同浓度的尿素做梯度透析。

1.1.5结果分析SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析各阶段产物及其纯度。

1.2表达蛋白活性检测

1.2.1主要材料抗卵巢癌单克隆抗体COC183B₂为本中心制备；溴化氰活化的Sephorose4B购自Parmacia公司；辣根过氧化物酶购自北方同正生物技术发展公司。

1.2.2测活所需的抗原的提取及标记（1）腹水癌细胞检测OC183B₂抗原阳性的病人腹水经饱和硫酸铵粗提两次，然后采用亲和层析提取抗原。亲和层析填料采用溴化氰活化的Sephorose4B，经活化后与平衡后的全抗体室温相偶联2 h后装柱，经乙醇胺封闭，醋酸缓冲液、硼酸缓冲液、硫氰酸钾洗涤后上样，并用3 mol^．L^－1硫氢酸钾洗脱，紫外分析仪检测。(2) 酶标抗原制备方法：亲和层析所得蛋白经浓缩透析后放入pH 9.2的0.001mol^．L^－1碳酸盐缓冲液中平衡备用。辣根过氧化物酶经醛化及透析后加入上述抗原室温避光搅拌2h，再加入新鲜配制的4g^．L^－1的硼氢酸钠，4℃ 2h，并透析，即可完成标记过程。

1.2.3免疫毒素的活性测定(1)抗体活性 用直接ELISA法检测。复性蛋白以10 mg^．L^－1在4℃包板过夜，HRP-抗原OC183B₂检测；超声裂解液上清（可溶性表达成分）用包被液梯度稀释后4℃包板过夜，用HRP-抗原检测。实验采用空载体pET30a（+）平行制备产物作为阴性对照。完整抗体COC183B₂作为阳性对照。(2) 毒素活性采用细胞毒实验(MTT法)检测。靶细胞为表达OC183B₂抗原的卵巢癌细胞系SKOV₃，阴性细胞对照为宫颈癌细胞系HeLa（OC183B₂ 抗原阴性）。将培养细胞按1×10⁵浓度接种于96孔培养板中。培养1d后，按梯度加入经透析的免疫毒素超声裂解上清。以空载体表达上清加入SKOV₃作为对照。24及48h后观察细胞形态。48h后加入MTT，37℃继续培养4h，加入酸性SDS终止反应，检测570 nm光密度值(D_570nm值)，并按下述公式计算杀伤率。

细胞生存率%=(实验组D_570nm－死细胞对照组D_570nm)/（活细胞对照D_570nm-死细胞对照D_570nm）

2结果

2.1高效表达载体的酶切鉴定（图2）

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