［摘要］ 目的：探讨神经递质降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP) 与银屑病皮损Langerhans细胞的相关性，研究银屑病的发病机制。方法：抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法确定CGRP的靶细胞，用双相间接免疫荧光染色法，把CD1a单克隆抗体和CGRP抗体作用于寻常型银屑病斑块型皮损同一切片，用PE-αM IgG和FITC-αR IgG 抗体显示，通过激光扫描共焦显微镜观察，并利用RNA探针原位杂交技术，研究表皮树枝状细胞CGRP的来源。结果：免疫组化染色银屑病皮损显示CGRP阳性表皮树枝状细胞，经双相免疫荧光染色及激光扫描断层光切，可见CGRP存在于银屑病皮损表皮CD1a^＋ Langerhans细胞膜表面，Langerhans细胞内有CGRPmRNA的表达。结论：寻常型银屑病斑块型皮损表皮Langerhans细胞与神经肽CGRP密切接触，同时Langerhans细胞内有CGRPmRNA的表达。

［中图分类号］ R758.63［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0313-03

Study on the relationship between calcitonin gene-related peptide

and Langerhans cells in psoriatic lesions

HE Yan-Ling

(Department of Dermatology, Peking University People's Hospital, Beijing100044, China)

DING Gui-Feng

(Department of Immunology)

ZHANG Bo

(Department of Pathonogy)

DEN Yiu-Lan

(Department of Immunology)

WANG Xian

(Department of Physiology， Peking University School of Basic Medical Sciences)

ZHU Tie-Jun

(Department of Dermatology, Peking University People's Hospital, Beijing100044, China)

FAN Shao-Guang

(Department of Physiology， Peking University School of Basic Medical Sciences)

ABSTRACTObjective: To investigate the relationship between Langerhans cells and calcitonin gene-related peptide(CGRP).Methods: Immunohistochemistry was used to determine CGRP expression in cells. Double immunofluorenscence staining was used for staining the section of psoriatic lesion. Confocal laser microscope was emplayed to examine the psoriatic epidermal. The source of CGRP on the dendritic cell was studied by RNA probe of CGRP in situ hybridization.Results: CGRP existed on the surface of CD1a^＋ epidermal Langerhans cells in psoriatic lesions. Expression of CGRP mRNA in the Langerhans cells was also detected.Conclusion: The epidermal Langerhans cells of the psoriatic plague lesion contacted closely with neuropeptide CGRP. Langerhans cells expressed CGRP mRNA.

KEY WORDSPsoriasis； Langerhans cells; Calcitonin gene-related peptide; RNA, messenger/metab

(J Beijing Med Univ, 2000,32:313-315)

为了进一步研究银屑病的发病机制，探讨神经肽与神经免疫调节在银屑病发病中的作用，本实验应用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法免疫组织化学染色，双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察，同时利用RNA探针原位杂交技术，研究降钙素基因相关肽与寻常型银屑病患者斑块型皮损病变的相关性，获得了有意义的结果。

1材料与方法

1．1材料

病例：寻常型银屑病12例（经临床和组织病理确诊），男8例，女4例，年龄22～65岁，病程2～32年。取背及四肢伸侧肥厚斑块型皮损。并以8名正常人的皮肤组织作对照。 试剂与仪器：hCGRP抗体（由我校生理学系王宪教授惠赠）；ABC免疫组化试剂盒（购自中山生物试剂公司）；鼠抗人CD1a mAb (NA 1/34,IgG2a, 丹麦DAKD公司)，PE标记抗鼠IgG抗体（PE-αM IgG抗体，我系），FITC标记抗兔IgG抗体（FITC-αR IgG抗体，军事医学科学院）。

CGRPcDNA质粒pBKSII-Exon 5 (由我校生理学系王宪教授惠赠)，限制性内切酶XhoI(宝泰克公司)，地高辛标记NTP (Dig-NTP)，抗地高辛-AP（抗Dig-AP）和NBT-BCIP（德国宝灵曼公司），T₇和T₃RNA聚合酶（GIBco公司），内切酶XbaI (鼎国生物公司），杂交液 (ssDNA、DTT、Denhardt、SSC、0.1g^．L^-1 Dextran Sulfate、甲酰胺 )。激光扫描共焦显微镜 （TCSNT型、德国Leica公司），DMRIXA显微镜和荧光显微镜（德国Leica公司）。

1．2方法

1．2．1抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物法免疫组织化学染色取斑块型皮损组织及正常对照组织，常规固定，石蜡包埋切片，脱蜡至80％（体积分数）酒精，3％（体积分数）H₂O₂甲醛封闭15 min，微波炉处理暴露抗原，血清封闭37℃孵育20 min，加入1∶500（体积比）兔抗人降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptid, CGRP)抗体，4℃孵育过夜，滴入1∶200（体积比）生物素化羊抗兔IgG抗体，37℃孵育30 min，常规TBS清洗，加1∶100（体积比）ABC液，37℃孵育50 min，DAB-H₂O₂染色，苏木素复染封片。阴性对照为PBS和未免疫兔血清。

1．2．2双相间接免疫荧光染色及激光共聚焦扫描观察取银屑病斑块型皮损及正常皮肤组织新鲜标本，OCT包埋冰冻切片，丙酮固定后PBS清洗。加第一抗体，先用鼠抗人CD1a mAb 1∶100（体积比），37℃孵育60 min，PBS清洗，后加兔抗人CGRP抗体1∶100（体积比），37℃孵育60 min，PBS清洗；再加第二抗体，先用PE标记抗鼠IgG抗体1∶20（体积比），37℃孵育60 min，PBS清洗，后加FITC标记抗兔IgG抗体1∶10（体积比），37℃孵育60 min，PBS清洗，缓冲甘油封片，在荧光显微镜及激光扫描共焦显微镜下观察。并以PBS和正常兔血清替代一抗作阴性对照，以鼠脊神经节细胞作阳性对照。

1．3CGRP原位杂交

1．3．1制备CGRP的RNA探针取CGRP质粒pBKSII- Exon5（3.2kb，含165bp的CGRP核苷酸系列）加入限制性内切酶XhoI，经37℃孵育，酶切使质粒线性化，用Tris酚：氯仿/异戊醇提取，乙醇沉淀及水重悬回收，以线性CGRPcDNA作为模板，转录RNA，加入地高辛标记NTP缓冲液（含Dig-NTP）和T₇RNA聚合酶，混合后在37℃孵育2～3 h，利用T₇启动子从5′端合成反义地高辛标记CGRP单链RNA探针，并用8 g^．L^-1琼脂糖凝胶电泳鉴定探针标记完成。另外，用内切酶XbaI在CGRP cDNA的另一端切开质粒，用T₃RNA聚合酶，从3′端合成正义CGRP单链RNA探针做对照。

1．3．2组织切片原位杂交寻常型银屑病斑块型皮损福尔马林固定，石蜡包埋切片，并将CGRP免疫组化阳性的皮损石蜡连续切片，常规脱蜡水化，TritonX-100室温孵育10 min，用1∶200 (体积比)蛋白酶K 37℃消化20 min，4％（体积分数）多聚甲醛固定，90％（体积分数）冰乙醇脱水。将杂交液与反义CGRP探针预处理，80℃加热10 min，把含探针的杂交液加入组织切片，置42℃孵育16～22 h，杂交后用50％（体积分数）甲酰胺SSC液在50℃洗2次，各20 min，马血清（1∶100体积比）封闭，37℃孵育30 min，加抗Dig-Ap (1∶500 体积比)，37℃孵育60 min ，Buffer I洗3次各5 min ，Buffer Ⅲ洗15 min ，NBT-BCIP染色，缓冲甘油封片，显微镜下观察。以脊神经节的神经细胞为阳性对照，无探针杂交液和PBS作阴性对照，并用正义CGRP单链RNA探针同时对照 。

2结果

2．1皮损组织中CGRP免疫组化染色形态学观察

在寻常型银屑病斑块型皮损中，可见CGRP分布于增厚的表皮和真皮乳头及浅层组织。在表皮见条索状排列的阳性表达颗粒穿过基底膜进入表皮细胞间（图1a），并见呈树枝状的阳性细胞，细胞表面有分枝突起（图1b），经连续切片做HE染色，未显示此阳性细胞。

图1a免疫组化:寻常型银屑病斑块型皮损见条索状排列的

CGRP阳性表达颗粒穿过基底膜进入表皮细胞间ABC法×100

Fig.1aImmunohistochemistry:CGRP positive nervous fibers extended

into the epidermal in psoriatic plaque lesions.ABC×100

1b免疫组化:银屑病斑块型皮损见呈树枝状的

CGRP阳性细胞，细胞表面有分