［摘要］目的:观察IL-4对诱导骨髓干细胞分化形成破骨细胞的作用。方法:用终浓度为10^－8 mol·L^－1的1,25(OH)₂D₃诱导成年小鼠骨髓干细胞分化形成破骨细胞,在此过程中加入不同质量浓度梯度的 IL-4(0、0.1、1、10 μg·L^－1) 以及用IL-4的抗体中和IL-4。取IL-4(1 μg·L^－1)处理过的第6天的培养上清液,先用抗IL-4抗体中和残余IL-4,再以体积分数1%,10%,20%,0加入另一新培养4 d含有骨片的骨髓细胞培养体系中,计数骨片上骨吸收陷窝数及面积,玻片上抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)阳性多核细胞和单核细胞数。结果:随IL-4(质量)浓度的增加,骨片上形成的骨吸收陷窝及面积数,玻片上的TRAP阳性细胞数呈量的依赖性的减少,加抗体组抵消了IL-4的抑制作用,加条件培养液组和未加组上述参数没有显著差别。结论:IL-4具有抑制骨髓干细胞分化形成破骨细胞的作用,这种作用不是通过使其它细胞形成可溶性因子,可能是直接作用于靶细胞(能分化为破骨细胞和巨噬细胞的前体细胞),使定向分化为TRAP阳性单核细胞的前体细胞转向分化为巨噬细胞, 破骨细胞数目减少,从而抑制了骨吸收。

［中图分类号］ R68-332［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0358-04

Effect of interleukin-4 on modulating osteoclast

differentiation and function in mouse bone marrow culture

WANG Xiao-Min

(Department of pathology, Peking University Stomatological Hospital, Beijing100081,China)

YU Shi-Feng

(Department of pathology, Peking University Stomatological Hospital, Beijing100081,China)

YANGZong-Ping

(Department of Stomatology, Peking University First Hospital)

ABSTRACTObjective: To observe the effect of IL-4 on murine hematopoietic stem cells differentiating into osteoclasts in mouse bone marrow induced by 1,25(OH)₂D₃.Methods: In the process of osteoclast formation from mouse bone marrow induced by 1,25(OH)₂D₃(10^－8mol·L^－1), IL-4 with different concentration (0μg·L^－1, 0.1 μg·L^－1, 1 μg·L^－1, 10 μg·L^－1) was added and another group was designed with anti-IL-4 antidodies. The cell-free supernants of cultures treated with IL-4(1 μg·L^－1) were preincubated with anti-IL-4 antibodies (1 g·L^－1)to block any residual active IL-4 and added to other fresh bone marrow cultures on day 4(0%-20% vol/vol). The number of bone resorption pits and area on bone slices and the number of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) positive cells on glass slices were counted.Results: The addition of IL-4(0.1-10 μg·L^－1)at the start of the culture period induced a dose-dependent decrease in the number of bone resorption pits, area; and TRAP positive cells. In the anti-IL-4 neutralizing group and conditioned medium groups, the parameters which were the same as the above, compared with the control group, had no significant difference in statistics.Conclusion: IL-4 could inhibit osteoclast formation from hepatopoietic stem cells in vitro. Such an effect did not seem to be mediated by release of other soluble factors from other cells, and it might directly acts on uncommitted precursors able to differentiate toward both osteoclasts and macrophages. The cytokine induced a preferential differention toward the macrophage phenotype, thus decreasing the generation of osteoclasts and inhibiting bone resorption.

KEY WORDSInterleukin 4/pharmacol; Osteoclasts/metab; Bone resorption; Tartrate-resistant acid phosphatase

(J Beijing Med Univ, 2000,32:358-361)

白细胞介素-4是由激活的T淋巴细胞和肥大细胞产生和分泌的免疫糖蛋白是造血细胞系许多细胞的生长分化因子，曾命名为B细胞生长因子。此外，它还影响骨骼的新陈代谢^［1］。Watanabe^［2］通过对胎鼠长骨器官培养，首次提出IL-4具有抑制破骨细胞性骨吸收的作用，但其作用机制不清。因为破骨细胞来源于造血细胞系前体细胞，而IL-4对一些造血细胞的分化具有调节作用，因此提出IL-4抑制破骨细胞骨吸收是否和破骨细胞生成的减少有关，国外的相关研究不多见，国内尚未见报道，本文用鼠骨髓破骨细胞培养体系检测IL-4对破骨细胞形成和功能的影响。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂α-MEM培养基，重组鼠的IL-4（购自Pepro Tech，INC.，抗IL-4抗体(西班牙JoseA.Riancho教授馈赠)，1，25(OH)₂D₃(协和医院内分泌科馈赠)。

1.1.2动物5周雄性NH小鼠(购自国家计划生育委员会动物室)。

1.1.3骨磨片和玻片按本室常规方法制备牛骨磨片磨至10 μm厚6mm×6mm，超声清洗，浸泡于双抗(青霉素1000u·ml^－1, 链霉素1000mg·L^－1)1h，换液3次;6mm×6mm玻片常规清洗，高压蒸汽灭菌。

1.2方法

1.2.1破骨细胞的诱导培养5周NH小鼠，乙醚麻醉下，断颈处死，无菌条件下取四肢长骨，去净软组织，用剪刀剪断长骨两端，用1 ml无菌注射器吸取α-MEM培养液由长骨一端冲洗骨髓腔，冲洗两遍，收集细胞悬液，筛网过滤，α-MEM洗两遍，最后悬于α-MEM全培养液［青霉素100 u·ml^－1，链霉素100 mg·L^－1，15%(体积分数)胎牛血清］内，其密度为5.5×10⁷ml^－1，每孔0.5 ml种于24孔培养板内。全培养液内加入1，25(OH)₂D₃终浓度为10^－8mol·L^－1。

1.2.2IL-4的添加及分组设计将IL-4加入细胞悬液内，质量浓度分别为0.1 μg·L^－1、1μg·L^－1、10μg·L^－1、1μg·L^－1+抗IL-4抗体1mg·L^－1、0 μg·L^－1，按不同质量浓度分组，每组8个孔，按前述质量浓度顺序加入骨片组记为a、b、c、d、e组；加入玻片组记为a′、b′、c′、d′、e′组，在骨片上计数骨陷窝数，在玻片上计数破骨细胞数。其中e组和e`组加入等量的PBS液作为对照组。每3天换液1次，每次添加相同浓度的1,25(OH)₂D₃和IL-4。取培养6d曾加入IL-4（质量浓度为1 μg·L^－1)的培养上清液，加入抗IL-4抗体1mg·L^－1以中和残余IL-4，以(体积分数)梯度0%，1%，10%，20%。放入含有骨片的新培养4 d的骨髓细胞培养孔内，定为A、B、C、D组。A组加入等量的PBS液作为对照组。

1.2.3倒置光相差显微镜下观察，摄影，计数观察细胞在骨片及玻片上的生长情况，于培养第5天，第7天，第12天，观察骨片上骨吸收陷窝情况，拍照，并计数骨吸收陷窝数。照片共60张(a、b、c、d、e，各10张)，同样放大倍数，利用LEICAQ550IW图象分析系统进行吸收陷窝面积分析。

1.2.4酶组织化学计数及分析抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色结果，于细胞培养第7天，骨片上出现骨吸收陷窝时，将a′、b′、c′、d′、e′，组玻片用PBS冲洗后，40 g·L^－1多聚甲醛固定8 min，于TRAP染色孵育液(0.1mol·L^－1醋酸缓冲液，pH 5.0 20 ml;AS-Bi 磷酸盐4mg溶于二甲基甲酰胺内;Fast GAR nett Gbc 10 mg;0.1mol·L^－1抗酒石酸300mg)内室温孵育15min，甲基绿复染。 TRAP染色阳性细胞呈紫红色，计数各组玻片上TRAP染色阳性单核细胞和多核细胞(含有3个以上的核)。

1.2.5统计分析各组吸收陷窝数及吸收面积，各组TRACP染色阳性单核及多核细胞数，采用SPSS软件的t检验进行分析。

2结果

2.1倒置光相差显微镜下形态学观察

细胞悬液种于培养板玻片上，可见满视野单核细胞，其中有许多红细胞，3 d换液后，细胞密度比较疏松，仍为单核细胞，但细胞贴壁延展，于培养第5天，细胞密度增大，可见多核细胞形成，单核细胞环绕其周围。在对照组玻片上多核细胞最多达40左右。对照组骨片上，细胞培养第5天偶见骨吸收陷窝（图1），第10天骨吸收陷窝数明显增多（图2），在培养第14天时，陷窝几乎遍布骨片，多处出现穿凿性骨破坏。

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