［摘要］ 目的：研究低密度脂蛋白受体相关蛋白6(low density lipoprotein receptor related protein6, LRP6)的胞内代谢及其与淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的相关性。方法：构建含有APP羧基端106个氨基酸的融合表达质粒，用酵母双杂交系统筛选人胎脑cDNA文库。结果：发现LRP6的羧基端可以和含有β淀粉样蛋白和胞内区的APP片段相互作用。结论：使与AD相关的两个重要蛋白载脂蛋白E和APP联系起来，并提示LRP6可能在APP的代谢和β淀粉样蛋白的产生中起重要作用。

［中图分类号］ R743.1［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0366-03

Amyloid precursor protein of Alzheimer disease can interact

with low density lipoprotein receptor related protein 6

CHANG Lei

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Peking University, Beijing100083, China)

MA Kang-Tao

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Peking University, Beijing100083, China)

ZHANG Nai-Heng

(Department of Biochemistry and Molecular Biology, Peking University, Beijing100083, China)

ABSTRACTObjective: To investigate the metabolism of low density lipoprotein receptor related protein 6 (LRP6) and its interactions with amyloid precursor protein(APP).Methods: A fusing expressed plasmid, which contains the 106 amino acids at the carboxyl terminal of APP, was constructed. Screening against human embryo brain cDNA library by two-hybrid system was performed.Results: Low density lipoprotein receptor related protein6 (LRP6) was found to interact with the carboxyl terminal of APP.Conclusion: This finding links the two Alzheimer disease (AD) related genes, apolipoprotein E (apoE) and APP together, indicating that LRP6 may play an important role in the metabolism of APP and production of β-amyloid protein (Aβ).

KEY WORDSAlzheimer disease； Amyloid beta-protein precursor/metab； Low density lipoprotein receptor related protein； Lipoproteins, LDL

(J Beijing Med Univ, 2000,32:366-368)

阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是威胁老年人群健康的重要疾病之一。淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)基因、Presenilin-1(PS1)、Presenilin-2(PS2)和apoE基因等与AD有关^［1］。β淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)是APP的代谢产物,它在AD发病过程中有重要毒害作用。低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density lipid related protein, LRP)是体内一类多配基受体，载脂蛋白E(apolipoprotein E, apoE)、 sAPP、α-微球蛋白等都是其配基。LRP也是AD发病的危险因素之一^［2］。

无论是APP的代谢，分泌，还是细胞内信号传导，其作用基础都是蛋白-蛋白间的相互作用。为此，我们设计利用APP羧基末端106个氨基酸片段，这一段包括胞内区和完整的Aβ片段，用酵母双杂交系统筛选人胎脑cDNA文库，寻找能和其相互作用的蛋白，希望能为APP的代谢、信号传导研究寻找新线索。结果发现LRP6可与其相互作用，并且这种相互作用局限于特定的肽段。

1材料与方法

1.1材料

two-hybrid system 的质粒和菌株购自Clontech，引物由生工生物公司合成，酵母培养基购自DIFCO，Rafnose购自Sigma，测序试剂盒为Promega产品，同位素为亚辉公司产品，内切酶、Taq 酶为华美公司产品，其它试剂为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1含APP羧基端106个氨基酸的表达载体构建及测序引物设计:上游5′-TTG GAT CCA GGA GAT CTC TGA AGT-3′，下游5′-TTG TCG ACT AGT TCT GCA TCT GCT CAA-3′。从APP cDNA中利用PCR扩增出约330bp 的片段，插入pUC18质粒，利用引物中的Bam HI和Sal I位点，将片段定向克隆入载体pEG202，构建质粒pEG202-CT106。测序引物为5′-GTC AGA TCT TTA GAC AAC ACC GCC CAC CAT-3′。

1.2.2转化酵母并筛选文库利用LiAc法，将质粒pEG202-CT106、pSH18-34转入酵母株EGY48，在营养缺陷培养基his^ura^的平皿上培养。再将含人胎脑cDNA文库的质粒pJG4-5转入已含有质粒pEG202-CT106、pSH18-34的酵母株EGY48。最终转化克隆数为1.07×10⁷，在缺陷培养基his^－ura^－trp^－leu^－Gal⁺Raf⁺的平皿上筛选克隆。30℃培养4～6d，直径大于1mm的为阳性克隆。

1.2.3阳性克隆的测序挑取阳性克隆，分离质粒，电穿孔法转化JM109菌株，酶切筛选获得含cDNA的pJG4-5质粒，测定阳性克隆的序列，测序引物上游5′-TGC CTC CTA CCC TTA TGA TGT G-3′，下游5′-GAC AAG CCG ACA ACC TTG ATT GGA G-3′。

1.2.4假阳性的去除将从阳性克隆中获得的含cDNA的质粒,报告质粒pSH18-34和pEG202-CT106重新转化酵母EGY48，取10个克隆在含0.1 mol^．L^－1葡萄糖的缺陷培养基his^－ura^－trp^－leu^－平皿上检测葡萄糖对LEU2报告基因激活的抑制作用，在含0.1 mol^．L^－1半乳糖和0.02 mol^．L^－1棉籽糖的缺陷培养基his^－ura^－trp^－leu^－验证LEU2的激活，并检测对lacZ报告基因的激活作用。以上3种作用缺乏任何一种则为假阳性。

1.2.5APP羧基端66氨基酸表达载体的构建同1.2.1，上游引物为5′-TTG GAT CCT CAT GGT GGG CGG TGT T-3′。获得pEG202-CT66质粒。

1.2.6LRP6的删除突变筛选文库获得阳性克隆pJG-LRP6CT347,利用LRP6羧基末端编码区的Xho I位点和载体上的Xho I 位点，删除羧基端173个氨基酸,获得pJG-LRP6CT174质粒。

1.2.7确定相互作用的蛋白区域将构建的质粒分4组转化酵母EGY48 分别是pEG202-CT106+pJG-LRP6CT347; pEG202-CT106+pJG-LRP6CT174; pEG202-CT66+pJG-LRP6CT347; pEG202-CT66+pJG-LRP6CT174;检测其对LEU2和LacZ基因的激活。

1.2.8分析测序利用GenBank搜索同源序列，分析测序结果。

2结果

含APP羧基端106氨基酸的质粒pEG202-CT106酶切图谱见图1。酵母双杂交筛得的阳性克隆106-14测序结果如下：

TCAATTTCCC CCGTGGCTTG GCGGTGCGAT GGGTTTACTG

AATGTGAAGA CCACAGTGAT GAACTCAATT GTCCTGTATG

CTCAGAGTCC CAGTTCCAGT GTGCCAGTGG GCAGTGTATT

GATGGTGCCC TCCGATGCAA TGGAGATGCA AACTGCCAGG

ACAAATCAGA TGAGAAGAAC TGTGAAGTGC TTTGTTTAAT

TGATCAGTTC CGCTGTGCCA ATGGTCAGTG CATTGGAAAG

CACAAGAAGT GTGATCATAA TGTGGATTGC AGTGACAAGT

CAGATGAACT GGATTGTTAT CCGACTGAAG AACCAGCACC

ACAGGCCACC ……

M， λDNA/Hind Ⅲ marker；

1， pEG202-106/BamH I+Sal I；

2， pEG202/BamH I+Sal I.

图1pEG202-CT106的构建

Figure 1Construction of pEG202-CT106

含有此序列的克隆在0.1 mol^．L^－1葡萄糖的培养基中LEU2基因完全不能表达，不能在缺乏亮氨酸的培养基上生长；在0.1 mol^．L^－1半乳糖，0.02 mol^．L^－1棉籽糖为糖源的情况下LEU2基因表达，能在缺乏亮氨酸的培养基上生长。在0.1mol^．L^－1半乳糖，0.02mol^．L^－1棉籽糖为糖源的情况下LacZ基因表达，α-半乳糖苷酶可以分解X-gal，呈现蓝色，结果见图2。说明APP的羧基端106个氨基酸和该克隆肽段之间存在一定的蛋白-蛋白相互作用。

A， inhibition of LEU2；

B， activa