［摘要］ 目的：分析EB病毒膜抗原(membrane antigen, MA)BLLF1基因在转基因小鼠外周血淋巴细胞中的表达。方法：EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因首建鼠4只，尾组织经PCR检测携带有BLLF1基因,用流式细胞仪分析MA在外周血淋巴细胞中的表达并用激光共焦显微镜确定MA在细胞中的表达部位。结果：4只首建鼠中有2只KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5外周血淋巴细胞中有MA的表达，表达部位在细胞浆中和细胞膜上。结论：表达EB病毒膜抗原的转基因小鼠可作为研究EB病毒致病机制的一个新的动物模型。

［中图分类号］ R392.11［文献标识码］ A［文章编号］ 1000-1530（2000）04-0326-02

Expression of Epstein-Barr virus BLLF1 gene in transgenic mice

GUO Chang-Zhan

(Department of Immunology)

HAN Wen-Long

(Department of Immunology)

PAN Xiu-Fang

(Department of Human Anatomy, Histology and Embryology)

ZHOU Wei-Min

(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine)

GU Shu-Yan

(Institute of Virology, Chinese Academy of Preventive Medicine)

TIAN Feng

(Department of Laboratory Animal Science, Peking University, Beijing100083, China)

LIU Bin

(Department of Human Anatomy, Histology and Embryology)

GAO Xiao-Ming

(Department of Immunology)

ABSTRACTObjective: To analyze the expression of Epstein-Barr virus (EBV) BLLF1 gene expression in peripheral lymphocytes of transgenic founder mice.Methods: BLLF1 expression in peripheral lymphocytes was analyzed by flow cytometry and the localization of expressed products in the lymphocytes was determined by confocal microscopy.Results: BLLF1 gene expression was detectable in two of the four transgenic founders. The expression products localise in the cytoplasm and on the surface of lymphocytes.Conclusion: Transgenic mice harboring EBV BLLF1 gene could be used as a model in pathogenesis of EBV.

KEY WORDSHerpesvirus 4, human; Antigens, viral; Gene expression; Mice, transgenic; Gene, BLLF1; Lymphocytes

（J Beijing Med Univ, 2000,32:326-327）

EB病毒是人群中普遍感染的病毒，大多数人可能终生潜伏感染。EB病毒在感染宿主细胞时，首先是病毒外膜上的膜抗原(membrane antigen, MA)与宿主细胞膜上的受体CR2 (CD21)结合，然后经胞饮进入宿主细胞。EB病毒MA是相对分子质量约为22 000～34 000的糖蛋白，CR2是主要表达于B细胞、T细胞和某些上皮细胞膜上的补体 C3d受体，因此EB病毒主要感染B细胞、T细胞以及部分上皮细胞，大量研究表明，EB病毒感染与自身免疫病、淋巴瘤以及某些粘膜恶性变有关^［1，2］。EB病毒MA在复制型感染时表达，潜伏感染的EB病毒在体内外因子的刺激下可多次活化从而表达MA。另有研究表明灭活的EB病毒在体外亦可以活化淋巴细胞，显然MA与宿主细胞受体的结合在淋巴细胞的活化中具有重要意义，为了探讨EB病毒感染和人类免疫系统疾病的关系，特别是EB病毒膜抗原在这一过程中的作用，我们用EB病毒膜抗原BLLF1基因制备了转基因小鼠^［3］。本文进一步研究BLLF1基因在转基因小鼠体内的表达。

1材料与方法1

1.1转基因小鼠

昆明种小鼠(KM)，用显微注射的方法将BLLF1基因导入单细胞期受精卵，再植入假孕母鼠的输卵管发育，共获得转基因首建鼠4只，分别命名为KM-Tg-EBV1、KM-Tg-EBV2、KM-Tg-EBV4和KM-Tg-EBV5。其中KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV2为雌性，KM-Tg-EBV4和KM-Tg-EBV5为雄性。

1.2MA在外周血淋巴细胞中表达的流式细胞仪分析^［4］

小鼠眼眶静脉丛采血200 μl，肝素抗凝，分装两管(对照管和实验管),加入用正常小鼠脾细胞吸收过的混合正常人血清60 μl作为一抗,对照管加等量PBS，4℃反应30 min。用含2%(体积分数)小牛血清的PBS洗两次(4℃，450×g离心，5 min)，去掉上清，加入FITC记的羊抗人IgG 60μl(北京北方同正生物技术公司产品，效价1∶20)，4℃反应30 min。加入1.0 ml红细胞裂解液，室温作用10 min，450×g离心，5 min，去掉上清，用含2%(体积分数)小牛血清的PBS洗两次(4℃，450 ×g离心，5 min)，细胞重悬于0.5 ml荧光保存液中，上机(Becton Dikinson FACS scan)检测。

1.3MA在外周血淋巴细胞中表达的激光扫描共聚焦显微镜分析^［5］

淋巴细胞悬液制备方法同1.2，加400 μl 100％(体积分数)甲醇固定，－20℃ 30 min，然后加2％(体积分数)的NP-40室温作用5 min以增加细胞膜的通透性。用PBS洗细胞两次，细胞复悬于100 μl PBS(pH7.4)中，MA表达染色方法同1.2，激光共焦显微镜为Leica TCS NT型。共聚焦系统由Leica公司提供的软件控制，FITC激发波长488 nm，步进马达控制显微镜聚焦旋钮，图像采集镜头为PIANNE-OFLUAR 40×油镜，数值孔镜(NA)为1.25，图像存贮为512×512像素类型，激光功率0.9～1 mW。

2结果

2.1BLLF1基因在外周血淋巴细胞中的表达

BLLF1是切去3′末端穿膜序列的EB病毒MA基因，表达的MA可分泌到细胞外，也可以结合在细胞膜上。分泌到细胞外的MA为糖基化完全的MA，而结合在细胞膜上的被认为是糖基化不完全的MA。流式细胞仪检测两只首建鼠（KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5）外周血淋巴细胞MA表达阳性。从图1A、1B可以看出实验管与阴性对照管相比，细胞平均荧光强度增加，表明MA在KM-Tg-EBV1和KM-Tg-EBV5小鼠外周血淋巴细胞中表达。另外两只首建鼠（KM-Tg-EBV2和KM-Tg-EBV4）外周血淋巴细胞中MA表达阴性(图1C)。

A， KM-Tg-EBV1； B， KM-Tg-EBV5； C， KM-Tg-EBV4；

Ⅰ， result with the second antibody only；

Ⅱ， result with both the first anti-MA polyclonal antibody

and the second anti-human immunoglobulin antibody.

图1MA在外周血淋巴细胞中表达的流式细胞仪分析结果

Figure 1MA expression in peripheral lymphocytes, cells were stained

by indirect immunofluorescence method and analyzed by flow cytometer

2.2BLLF1基因在外周血淋巴细胞表达部位

激光扫描共焦显微镜不但能对单个细胞细胞膜荧光染色进行观察，还可以提高分辨率并可进行断层扫描以确定抗原表达部位。图2为同一个淋巴细胞的荧光染色图像(a)及断层扫描图像(b)。从图2b可以看出，MA表达在细胞膜上及细胞浆中。

a, a lymph node cell fluorescently stained with FITC labled antibody under

a laser scan confocal microscope; b, layered scan of the same cell.

图2MA在外周血淋巴细胞中的表达部位

Figure 2Localization of MA expressed in peripheral lymphocytes

under a laser scan confocal microscope.

3讨论

EB病毒的基因组长172kb，有84个开放读码框架，在EB病毒转化的淋巴细胞中至少可编码9种蛋白。但因EB病毒在自然状态下不能感染小鼠，因此用常规方法不能建立EB病毒感染的小鼠模型。EB病毒BLLF1转基因小鼠的建立为研究EB病毒感染的致病机制解决了这一难题。

自然感染的EB病毒在人体内处于潜伏感染状态时表达潜伏蛋白，有核蛋白(EB virus nuclear antigen, EBNA ) 和潜伏膜蛋白 ( latent membrane protein, LMP)，在活化感染状态时还表达膜抗原。而这些蛋白在致病中各自都起什么作用用常规的动物模型较难确定。BLLF1转基因小鼠外周血淋巴细胞中表达MA，为探讨MA在EB病毒感染中的致病作用提供了一个新的动物模型。多年来人们在研究EB病毒感染与人类疾病的关系时，注意力多集中在EBNA和LMP上，而对M