［摘要］ 目的:评价转促凋亡基因胃癌细胞的光动力学治疗效果。方法：分别用携带野生型p53cDNA和反义bcl-2序列的逆转录病毒转导胃腺癌细胞系MGC803，稳定表达后加光敏剂并红光照射，检测细胞存活及凋亡。结果：在光敏剂及红光作用下野生型p53及反义bcl-2都能使转导细胞的存活率降低，凋亡增加。结论：野生型p53及反义bcl-2可增加光敏剂2-丁胺-2-去甲氧基竹红菌甲素对细胞的光敏毒性。细胞对光敏剂诱导凋亡的敏感性明显增高。推测该光敏剂的光动力治

途径可能以诱导细胞凋亡为主。

［中图分类号］R735.2［文献标识码］A

［文章编号］1000-1530（2000）03-0265-04

A study of photodynamic therapy for the gastric adenocarcinoma

cell line transduced by the genes relating to apoptosis

MA Li-Ping，CAO Guo-Dong，WANG Shen-Wu

（Central Laboratory, People's Hospital, Peking University, Beijing100044，China）

ZHANG Wen-Geng，ZHANG Zhi-Yi

（Institute of Biophysics, Academia Sinica）

ABSTRACTObjective: To estimate the efficiency of transferring genes relating to apoptosis combined with photodynamic therapy for the gastric adenocarcinoma. Methods: Transduction of the retrovirus vectors carrying wild-type p53cDNA and antibcl-2 sequence to a gastric adenocarcinoma cell line MGC803 was carried out respectively. After screening by G418, the photosensitizer 2-butylamino-2-demethoxy-hypocrellin A (2-BA-2-DMHA) and the red light were administered. Then the survival rate of the cells and their apoptosis were detected. Results: Under the condition of 2-BA-2-DMHA and red light, wild-type p53 and antibcl-2 could reduce survival rate and increase apoptosis. Conclusion: Both wild-type p53 and antibcl-2 may enhance the phototoxicity of 2-BA-2-DMHA and promote the apoptosis in MGC803 cells. The main photodynamic role of 2-BA-2-DMHA in the tumor cells may be to induce apoptosis.

KEY WORDSStomach neoplasms/ther； Apoptosis; Phototherapy； Gene therapy; Kinetics▲

参与肿瘤发生的多个遗传事件中，重要的是抗凋亡基因的激活和诱导凋亡基因的失活。基因治疗诱导细胞凋亡已成为肿瘤研究的热点之一。单独的基因治疗尚有许多不足，将转基因与DNA损伤剂（如放疗、化疗和光动力治疗）联合应用可克服一些缺陷。

光动力治疗是光动力反应应用于临床（主要是肿瘤治疗）的一种特殊类型，是一种新的两步法治疗手段。即首先给予一种主要定位于肿瘤的光敏药物（或称光敏剂），利用特定波长的可见光激活光敏剂而发生一系列光化学和光生物学反应，导致肿瘤组织的不可逆损伤。我们已报道过携带人野生型p53cDNA和反义bcl-2序列逆转录病毒载体的构建，及转导的靶细胞稳定表达外源基因^［1～3］，本文对在光疗窗口有强吸收峰的新型光敏剂2-丁胺-2-去甲氧基竹红菌甲素（2-bulylamino-2-demethoxy-hypocrellin A，2-BA-2-DMHA）在已转入上述两基因的MGC803细胞中诱导凋亡进行了研究，细胞存活和细胞凋亡研究显示p53及反义bcl-2的高表达都能明显增加光敏剂2-BA-2-DMHA对细胞的光敏毒性，细胞对2-BA-2-DMHA诱导凋亡的敏感性明显增高。

1材料与方法

光敏剂:新型光敏剂2-BA-2-DMHA由中国科学院感光化学研究所合成。

野生型p53及反义bcl-2逆转录病毒载体（pLXSN-p53、pLXSN-antibcl-2）构建、鉴定、包装、筛选及病毒滴度测定参见文献［1，2，4］。

MGC803细胞培养及转导见文献［3］。不加病毒的亲本MGC803命名为MGC803-S，表达野生型p53及反义bcl-2的细胞分别命名为MGC803-p53和MGC803-antibcl-2，携带空载体细胞命名为MGC803-Neo。

光敏剂处理及红光照射^［3］：在无血清无酚红的液体培养基中，用不同浓度的2-BA-2-DMHA处理对数生长期细胞，37℃ 1h。胰酶消化，PBS洗2次后，重悬于无酚红无血清的培养基中，并转入35mm培养皿内，细胞数为3×10⁵，用不同剂量的红光照射，光源为红光治疗仪（波长200～700nm，中国科学院电子研究所制造）。光照结束后加含胎牛血清的培养基使血清为5%（体积分数）,用于以下研究。

存活细胞计数:经不同处理的细胞（3×10⁵）接种到24孔培养板，37℃培养24h，胰酶消化，台盼蓝染色计数存活细胞，每一样品4孔，至少重复两次。

末端转移酶生物素标记检测细胞凋亡（TUNEL）^［5］。将对照细胞和0.25μmol·L^－1 2-BA-2-DMHA加上10 J/cm²红光照射细胞按不同培养时间胰酶消化后涂片，40g·L^－1多聚甲醛固定，生物素末端转移酶标记系统（Boehringer Mannhein公司）进行细胞原位标记，经SA-AP、BCIP、NBT系统显色。

流式细胞仪检测细胞凋亡。取不同处理的各细胞1×10⁶，按不同培养时间,胰酶消化后离心,重悬于PBS,乙醇固定,RnaseA消化，加PI（碘丙啶）至10mg·L^－1,流式细胞仪检测具有亚二倍体DNA的细胞数。

2结果

2.1光敏剂对不同状态胃癌细胞的暗毒性

经RT-PCR、Western blotting检测，野生型p53基因及反义bcl-2序列可以经逆转录病毒转导在靶细胞稳定表达^［2，3］。MGC803-S、MGC803-Neo、MGC803-antibcl-2 3种细胞对2-BA-2-DMHA的摄取没有明显区别，0.25μmol·L^－1、1μmol·L^－1和10 μmol·L^－1 2-BA-2-DMHA对这些细胞的暗毒性相近^［3］；MGC803、MGC803-Neo、MGC803-p53对2-BA-2-DMHA的摄取及暗毒性也没有明显区别，即相同条件下，这些细胞的光敏毒性是可以比较的。

2.2不同状态胃癌细胞的光敏毒性

台盼蓝计数结果显示，MGC803-p53对2-BA-2-DMHA 光敏毒性明显高于MGC803-S和MGC803-Neo。在0.25 μmol·L^－1 2-BA-2-DMHA处理加10J/cm²红光照射再培养24h,MGC803-S和MGC803-Neo细胞存活率为52.88%,而MGC803-p53为13.21%,下降了3倍。MGC803-antibcl-2细胞对2-BA-2-DMHA处理的敏感性明显高于MGC803-S和MGC803-Neo。同样条件处理后，2-BA-2-DMHA对MGC803-antibcl-2的光敏毒性是MGC803-S和MGC803-Neo细胞的7倍（图1）。这种存活率的差异在光照后48h仍然存在。

Ψ, radiant energy fluence.

1MGC803不同处理细胞的存活率

(0.25 μmol·L^－1 2-BA-2-DMHA,加不同剂量光照）

Figure 1Survival rate of MGC803 with different conditions

(0.25μmol·L^－1 2-BA-2-DMHA,different light dose)

2.3光敏剂/光照处理不同状态胃癌细胞的凋亡

MGC803-p53及MGC803-antibcl-2出现凋亡的时间明显早于对照细胞。细胞凋亡原位检测显示，在0.25 μmol·L^－1 2-BA-2-DMHA加10 J·cm^－2红光照射处理后3 h即可在MGC803-p53和MGC803-antibcl-2中观察到凋亡细胞，其强度在二者无明显差异,并随继续培养的时间延长而增强(图2)。吸光度扫描：光照后3 h和12 h分别为0.32±0.03及0.69±0.04(P＜0.01)，而用相同的条件处理,MGC803-S和MGC803-Neo要在12 h才能检测到细胞凋亡(吸光度扫描为0.21±0.02,与MGC803-p53及MGC803-antibcl-2比较，P＜0.01）。单独用光敏剂处理或单独用红光照射均未观察到明显细胞凋亡(吸光度扫描为0.12±0.02,与其他处理比较，P＜0.01)。流式细胞仪计数分析G₁期前出现的DNA亚二倍体峰,无光敏剂及光照的MGC803-antibcl-2、MGC803-S及MGC803-Neo之间区别不大,为1.2%～1.5%。MGC803-antibcl-2在0.25 μmol·L^－1 2-BA-2-DMHA加上10 J/cm²红光照射处理后1h的亚二倍体峰为8.8%,8h为18.7%,12h为38.6%（P＜0.01），同样随时间而增强（图3），且出现凋亡的时间略早于用TUNEL检测出现的时间。MGC803-p53也出现类似的结果。在同样光敏剂浓度及光照条件下，MGC803-S及MGC803-Neo在10h才出现亚二倍体峰(7.8%～8.1%)。

a, 3 h after 2-BA-2-DMHA and light; b, 12h after 2-BA-2-DMHA and light.

2MGC803-p53中的TUNEL阳性细胞（2-BA-2-DMHA：0.25 μmol·L^－1