［摘要］ 目的：探讨灵芝浸膏(Ganoderma lucidum Extract, GLE)的抗肿瘤作用及其机制。方法：采用血清药理学与体内外抑瘤实验相结合方法。MTT法测肿瘤细胞增殖程度，流式细胞仪测细胞凋亡，同时采用生物法测TNF-α，ELISA测定IFN-γ，并用RT-PCR方法检测mRNA表达。结果：(1)GLE(5、10、20 g^．kg^－1)灌胃显著抑制小鼠移植性肉瘤S180的生长；（2）GLE直接加入S180细胞体外培养不能抑制其生长，亦无诱导其凋亡的作用；（3）GLE血清显著抑制S180细胞生长并诱导其凋亡，GLE血清中TNF-α、INF-γ水平显著升高，而且GLE显著促进其mRNA的表达。结论：GLE无直接的抗肿瘤作用，其抗肿瘤作用是通过促进TNF-α和INF-γmRNA表达及其生成而实现的。

［中图分类号］ R282.7105［文献标识码］ A

［文章编号］ 1000-1530（2000）03-0210-04

Study on the antitumor mechanism of Ganoderma lucidum Extract(GLE)

by serologic pharmacological method

ZHANG Qun-Hao, YU Dong-Hui, LIN Zhi-Bin

(Department of Pharmacology, School of Basical Medical Sciences,

Peking University, Beijing100083, China)

ABSTRACTObjective: To study the antitumor activity and the mechanism of Ganoderma lucidum Extract (GLE) Methods: Serologic pharmacological method, and both in vivo and in vitro antitumor experiments were used in the studies. Proliferation of tumor cells was detected by MTT, TNF-αwas detected by biological assay, and INF-γby ELISA. The level of mRNA was detected with the method of RT-PCR. Results: (1) GLE (5, 10, 20g^．kg^－1, i.g.) inhibited the growth of implanted sarcoma 180 in vivo significantly and dose-dependently. (2) GLE directly adding to their cultured medium neither induced sarcoma 180 apoptosis nor restrained its proliferation in vitro. (3)GLE-treated serum significantly induced sarcoma 180 apoptosis and inhibited its proliferation. The TNF-αand INF-γraised in the cultured medium treated with GLE-treated serum, GLE (5, 10, 20g^．kg^－1, i.g.) significantly increased TNF-α and INF-γmRNA expression in mice. Conclusion: The anti-tumor activity of GLE was derived from promoting mRNA expression of TNF-αand INF-γ, resulting in the production of TNF-αand INF-γ.

KEY WORDSSerologic pharmacology； Ganoderma lucidum Extract； Apoptosis； TNF-α； INF-γ▲

灵芝浸膏（Ganoderma lucidum Extract,GLE）系从灵芝［赤芝，Ganoderma lucidum (Leyss.ex Fr.) Karst.］子实体中提取的水溶部分。一系列研究证明灵芝及其所含多糖具有抗肿瘤作用，并推测其抗肿瘤作用与其免疫增强作用有关^［1］，但关于灵芝的抗肿瘤机制至今尚未完全阐明。本文采用血清药理学方法^［2］，从整体、细胞、分子水平，体内、外实验相结合，观察了GLE的抗肿瘤作用及其机制。

1材料与方法

1.1药品与材料

GLE：由天安制药（厦门）有限公司提供，系灵芝子实体热水提取物，每10 g生药提取1 gGLE。

依托泊苷（Etoposide, VP-16）：连云港制药厂。环磷酰胺（Cyclophosphamide， CY）：上海华联制药公司。

L929细胞：购自北京大学基础医学院免疫学系。HL-60、S180细胞：购自北京肿瘤研究所。小鼠ELISA INF-γ试剂盒：美国Endogen公司产品。TRIZOL试剂（RNA提取剂）：Gibco BRL公司产品。RT-PCR试剂盒：美国Promega公司产品。

1.2实验动物

BALB/c近交系小鼠，体重18～22 g，合格证号01-3046，购自我校实验动物部。

1.3试验方法

肿瘤细胞体外增殖试验:采用MTT方法^［3］，小鼠S180肉瘤的抑瘤试验采用常规方法^［4］，肿瘤细胞凋亡采用流式细胞仪测定^［5］。

GLE血清制备：GLE（20、10、5 g·kg^－1，按其生药含量折算）分别溶于0.4 ml蒸馏水中，正常对照组用生理盐水0.4ml，以上过程每天1次，连续灌胃10d，于最后一次灌胃后1h，摘眼球取血，无菌分离血清，用0.45μm微孔滤膜过滤除菌，－20℃保存备用。

细胞因子检测：收集GLE血清，用结晶紫染料摄入法^［6］测定培养上清液中TNF-α的含量，用小鼠INF-γ ELISA试剂盒测定INF-γ含量。

RT-PCR方法：正常健康BALB/c小鼠颈椎脱臼处死，常规制备BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞（peritoneal macrophages, PM）和脾淋巴细胞，分别于含PM和脾淋巴细胞的细胞培养瓶中加入不同浓度的药物和LPS(5 mg·L^－1)和ConA(2.5mg·L^－1)，培养48 h后用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，紫外可见光分光光度计对RNA样品定量。RT-PCR检测TNF-α、INF-γ及β-actin mRNA的表达，扩增反应条件参照试剂盒操作手册，反应体系为50μl，反转录与PCR一步完成。引物根据文献资料设计^［7，8］，由中科院微生物所合成。序列为：TNF-α产物422 bp; INF-γ产物220bp;β-actin产物478bp。

取RT-PCR产物10μl，加入2 μl上样缓冲液混合，加样于15 g·L^－1的琼脂糖凝胶，分别以385、485、585bp和154、220、344bp的DNA片段为DNA marker，0.5×TBE为电泳缓冲液，5 V/cm恒压电泳2 h检测RT-PCR产物，紫外透射仪观察并照像。RT-PCR结果用图像分析仪对胶片上每一泳带进行光密度扫描定量，结果用各组的光密度值与β-actin的光密度之比表示。RT-PCR结果以3次以上实验测定值与相应对照的比值的±s表示。

1.4统计学方法

各组间的显著性检验均采用Duncan's test, ANOVA，SAS 6.04。

2结果

2.1灌胃GLE对BALB/c小鼠移植性S180肉瘤的抑制作用

给小鼠皮下接种S180后，连续灌胃GLE (5、10、20 g·kg^－1) 10d可以显著抑制S180的生长，并呈剂量依赖关系，其抑瘤率分别为22.77%、41.58%和60.89%（表1），与生理盐水组比较，差异有显著性。

表1灌胃GLE对BALB/c小鼠移植性S180肉瘤生长的影响（n=10,±s）

Table 1Effect of GLE on growth of implanted Sarcoma 180

in BALB/c mice (n=10,±s)

Groups Dose

(i.g.×10 d) m(body)/g m(tumor)

/mg Inhibitory rate

（%） before difference NS － 23.61±1.40 10.32±2.60 2.02±0.16 GLE(g·kg^－1) 5 22.86±1.78 6.24±1.50^* 1.56±0.50 22.77 10 23.16±1.53 7.01±1.43^** 1.18±0.41^* 41.58 20 23.67±1.24 6.52±1.36^** 0.79±0.45^** 60.89 CY(mg·kg^－1) 20 23.84±1.43 5.84±1.68^** 0.44±0.54^** 78.02

m, mass; NS, normal saline; GLE, Ganoderma lucidum Extract; CY, cyclophosphamide; *P＜0.05, **P＜0.01vs NS．2.2GLE、GLE血清对S180细胞体外增殖的影响

表2显示，直接加GLE至体外培养的S180细胞培养基中，GLE对S180细胞的生长并无抑制作用。而给小鼠灌服GLE（5、10、20 g·kg^－1）后取其血清加至体外培养的S180细胞中，则对S180细胞的生长有显著的抑制作用，并呈剂量依赖关系，与RPMI1640对照组及生理盐水血清对照组相比，差异有显著性。

表2GLE、GLE血清对S180细胞体外增殖（n=8)和

凋亡(n=3)的影响（±s