摘要目的：深入探讨手性铂络合物与DNA作用的分子机制，寻找抗癌铂络合物的设计规律。方法：用生物量热技术、DNA Tm测量、粘度滴定及NMR技术研究了手性不同的环方铂及环斑铂与CT-DNA的作用。结果：发现环方铂是通过方酸根的离去与DNA碱基之间形成共价键而结合的,而环斑铂是通过嵌插到DNA碱基对之间以非共价方式与DNA结合的。通过HPLC研究发现这两类铂络合物与DNA结合的碱基特异性完全不同。结论：本研究发现铂络合物对DNA的识别作用是手性相关的，这与癌细胞体外筛选的结果一致。通过计算机分子图形学对以上实验结果从理论上进行了初步分析。

中图分类号R979.1文献标识码A

文章编号1000-1530（2000）03-0198-05

Molecular recognition of two binding modes

of DNA with novel chiral Pt-complexes

YANG Ming，XIAO Su-Long， ZHOU Tian-Yan，ZHANG Jia-Mei，WANG Kui

（National Research Laboratory of Natural and Biomimetic

Drugs, Peking University, Beijing100083, China）

WANG Bao-Huai， LI Zhi-Fen

（Institute of Physical Chemistry, College of Chemistry and Molecular Engineer, Peking University）

MENG Xing-Lian

（Drug Quality Control Institute, DaTong, Shanxi Province）

ABSTRACTObjective: To study the molecular mechanism of the interaction between DNA and chiral Pt-complexes. Methods: Two kinds of binding modes between DNA and the chiral isomers were evaluated by bio-microcalorimetric techniques and DNA Tm measurements. The binding molecular mechanism of R,R-SA-Pt and DNA was investigated by¹³CNMR and DNA viscosity titrations. The binding specificity study of DNA base with the two kinds of novel Pt-complexes was conducted by HPLC. Results: Covalent binding and noncovalent binding interaction were evaluated, and DNA binding specificity differences between R,R and S,S-isomers were found. Conclusion: The effects of the chirality of the 1,2-diaminocyclohexane isomers and stereochemistry of the whole complexes on their anticancer activities and DNA molecular recognition have been discussed.

KEY WORDSPlatinum complexes; DNA; Molecular structure; Antineoplastics agents/chem; Drug design▲

自1969年顺铂出现至现在成为临床上广泛应用的一类抗癌药，其飞速的发展虽标志着无机药物的复兴，但后来研制的上千种铂络合物中抗癌活性能超过顺铂的并不多见^［1］。这说明仅靠机遇筛选来发现药物的旧模式极待改进。在抗癌铂络合物的设计中迫切需要以深入的药物作用分子机制研究为基础，寻找抗癌铂络合物的设计规律，开展以生物大分子为靶的理性药物设计。

近来，生命过程中的手性特异性现象越来越受到人们的关注，手性药物的研究也引起了生物学家的极大兴趣^［2］。但是对于手性药物分子与DNA的分子识别研究还很不充分。为了研究手性药物对DNA的分子识别作用，特别是为了深入探讨手性铂络合物与DNA作用的分子机制，为抗癌铂络合物的设计提供依据，在抗癌活性筛选的基础上^［3］，我们对于新合成的两类铂络合物，环己二胺方酸合铂——环方铂（R,R-SA-Pt；R,S-SA-Pt；S,S-SA-Pt；结构式如图1左）及环己二胺去甲斑蝥酸合铂——环斑铂（R,R-DC-Pt；R,S-DC-Pt；S,S-DC-Pt；结构式如图1右）的手性和立体化学对DNA的分子识别及DNA结合的碱基特异性的影响进行了研究。

图1新的铂络合物结构

Figure 1Structures of the novel Pt-complexes

1材料与方法

1.1药品

环方铂及环斑铂均由邹娟博士惠赠。其它试剂均购于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1微量量热使用美国CSC公司4200型等温滴定量热计,其最低测量热功率为0.2 μW。实验平衡时间200 s,每滴15 μl，每滴间隔480 s，实验温度为298.15 K。

1.2.2粘度滴定CT-DNA及其与环斑铂或环方铂作用后的粘度测定是采用Cannon-Fenske改进的Ostwald粘度计，参照文献［4］方法在（30.2±0.05）℃在PIPES00缓冲液中进行。用于计算相对粘度平均值的每个时间数据至少要连续重复3次。

1.2.3DNA解链温度（Tm）测定DNA变性实验在法国Setaram公司产的微量显示扫描仪MicroDSC-Ⅲ上进行，实验温度为283.15～383.15 K，计温速度为1 K*min^－1［5］。

1.2.4HPLC用CS-1000型高效液相色谱柱，ODS-C18填料，柱压7．5×10⁶～12．7×10⁶Pa，流速1ml*min^－1，检测波长254nm。流动相Ⅰ: 5%(体积分数)MeOH+20 mmol*L^－1KH₂PO₄，流动相Ⅱ:10%(体积分数)MeOH+20 mmol^．L^－1KH₂PO₄(溶剂均为双蒸水)。将药物与单个核苷酸按一定比例(摩尔比1∶1)进行混合，放置反应24h后，进行测定，观察加药后保留时间。根据峰面积的改变及是否有新峰出现研究药物对碱基对特异性反应。

1.2.5NMR研究在Bruker ARX 400 MHz超导核磁谱仪上分别测定方酸、环方铂、环方铂-DNA溶液的¹³CNMR谱及去甲斑蝥酸、环斑铂、环斑铂-DNA溶液的¹HNMR谱，测定温度为25℃。D₂O磷酸缓冲液为溶剂。

1.2.6分子图形学研究R,R-SA-Pt 及S,S-SA-Pt分别与DNA G或C碱基形成的复合物时的能量计算是在SGI Indy工作站，使用Tripos Sybyl软件进行。

2结果

2.1微量量热

表1列出了环方铂及环斑铂的3种不同构型化合物与CT-DNA作用的摩尔焓变值。

表1新的手性铂络合物与CT-DNA作用的摩

尔焓变 (Δ_rH_m)及结合位点数（n）

Table 1The enthalpy changes（Δ_rH_m） and binding site numbers (n) for

the binding of the new chiral Pt-complexes with CT-DNA at 298.15 K

Complexes Δ_rH_m（kJ·mol^－1） n R,R-SA-Pt －338.1 0.34 R,S-SA-Pt －79.0 0.18 S,S-SA-Pt 0 0 R,R-DC-Pt －7.2 1.10 R,S-DC-Pt －1.1 0.98 S,S-DC-Pt 16．0 1.00

微量量热实验测定的是体系所有热效应的总和，从量热数据可以看出环方铂与DNA之间发生了较强的作用，所测得的标准焓变值属于共价键的范围，而环斑铂与DNA相互作用的标准焓变值均小于50kJ·mol^－1,属于非共价键的范围。这在顺铂类配合物中比较少见。

2.2Tm的测定

为了进一步证实新的铂络合物与DNA的相互作用及考察其对DNA双螺旋氢键的影响，又进行了DNA解链温度的测定。表2列出了CT-DNA及加入铂络合物后，解链温度的变化ΔTm及相应解链摩尔焓变Δ_mH_m值。

表2CT-DNA及加入铂络合物后的ΔTm及相应Δ_mH_m

Table 2ΔTm andΔ_mH_m of DNA in the presence and absence of

1,2-cyclohexanediamino-Pt complexes

Complexes ΔTm(K) Δ_mH_m(kJ·mol^－1) DNA 0 15.70 R,R-SA-Pt －2.20 11.00 R,S-SA-Pt －1.40 10.20 S,S-SA-Pt －0.60 13.30 R,R-DC-Pt 7.66 9.26 R,S-DC-Pt 3.56 10.70 S,S-DC-Pt 8.53 16.60

2.3粘度滴定

图2为R,R-DC-Pt，R,S-DC-Pt，S,S -DC-Pt及R,S-SA-Pt对 DNA<