［摘要］ 目的：研究抗真菌天然产物澳洲茄胺、白鲜碱、紫檀、7-羟基-4′-甲氧基黄烷对威克海姆原藻超微结构的影响，以期阐明药物对真菌细胞的作用机制。方法：采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察正常细胞及用药组细胞的超微结构。结果：观察到用药组细胞与正常细胞超微结构的差异。结论：为阐明药物对细胞的作用机制提供了部分依据。

［中图分类号］ R798.5［文献标识码］ A

［文章编号］ 1000-1530（2000）03-0219-04

Effect of four antifungal natural products

on ultrastructure of Prototheca wickerhamii

WANG Li-Da，GUO De-An，HU Ying-Qing，TU Peng-Fei，GONG Yu-Jing，ZHENG Jun-Hua

(School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing100083, China)

ABSTRACTObjective: To study the effect of antifungal natural products on ultrastructure of Prototheca wickerhamii and clarify the antifungal mechanism of these antifungal natural products. Methods: The ultrastructures of normal and treated P. wickerhamii cells by scanning and transmission electronic microscope were observed. Results: It was found that the morphology of the treated cells with antifungal natural products changed greatly, e.g. the damage of the inner layer of the cell wall, the degradation of the membranous organelles. Conclusion: The observation results provided some scientific data for the identification of antifungal mechanism of four natural products.

KEY WORDSPrototheca wickerhamii; Fungi/ultrastruct; Antifungal agents(TCD)/pharmacol; Fungi/drug eff▲

威克海姆原藻（Prototheca wickerhamii）是一种分类地位一直存有争议的微生物，一说其属于真菌类，有酵母样菌落，但无出芽生殖方式，而以内生孢子进行繁殖，另外从其细胞膜的成分上也是合成甾醇类化合物作为细胞膜的框架结构，其甾醇的生物合成途径与真菌极其相近。一说其属于藻类，但又是缺乏叶绿体和淀粉核的异养生物。更有学者认为其居于二者之间^［1～4］。现在大多数学者把它归为绿藻门，称为无绿藻，是绿藻的变种，失去了原有藻类的叶绿素，寄生或腐生于木材、蔬菜和粪便中，引起人皮肤、皮下组织、口腔、鼻、浆膜等处病变，统称无绿藻病（protothecosis），偶尔可引起系统性感染^［5］。临床上仍把无绿藻病归为真菌病， 用抗真菌药物治疗。自Davies等^［6］1964年报道首例无绿藻病至今，全球已发现近百例且有上升趋势，对该病尚无特别有效的治疗药物，往往需要手术治疗。抗真菌天然产物对威克海姆原藻的作用迄今未见报道。

澳洲茄胺(Solasodine)属甾体生物碱，甾体生物碱及其糖苷存在于茄科茄属（Solanum）的大多数植物中，具有包括抗真菌在内的多种生物活性。白鲜皮系Dictamnus dasycarpus (Rutaceae)的根皮，其水提物在体外对许多人类致病真菌有抑制作用，其中白鲜碱(Dictamnine)是活性最高的有效成分。经体外抗真菌试验证明，紫檀(4′-hydroxy-3,5-dimethoxystilbene)和7-羟基-4′-甲氧基黄烷(7-hydroxy-4′-methoxyflavan)对近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）、隐球菌（Cryptococcus neoformans）、白色念珠菌（Candida albicans）、红色毛癣菌（Trichophyton rubrum）、须癣毛癣菌（Trichophyton gypseum）及烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）都有较好活性。

我们对正常细胞及分别加入上述4种抗真菌天然产物的用药组细胞的超微结构进行了对比观察，以期阐明药物对细胞的作用机制，并为开发新的抗真菌药物奠定基础。

1材料与方法

1．1材料

威克海姆原藻菌种由W. David Nes博士( Department of Chemistry and Biochemistry, Texas Tech University, Lubbock, Texas, USA) 赠送。

1．2仪器、药品与试剂

1．2．1仪器HZQ-Q全温振荡器（哈尔滨东联电子技术开发公司）；超净工作台（北京半导体一厂）；扫描电子显微镜（日立HITACHI S450型）；透射电子显微镜（日立HITACHI H500型）。

1．2．2药品蛋白胨（Peptone，购自DIFCO公司）；酵母提取物（Yeast Extract，购自OXOID公司）；葡萄糖（汕头市光华化学厂）；澳洲茄胺（Solasodine, 由W. David Nes博士赠送）；白鲜碱（Dictamnine, 作者从白鲜皮中提取分离得到），紫檀和7-羟基-4′-甲氧基黄烷由北大药学院胡迎庆硕士从剑叶龙血树Dracaena cochinchinensis (Lour.) S. C. Chen中提取、分离并鉴定其结构。

1．2．3试剂均为分析纯（AR）。

1．3方法

1．3．1P. wickerhamii的培养培养基为蛋白胨20 g^．L^－1，葡萄糖20 g^．L^－1，酵母提取物10 g^．L^－1。每100 ml培养基加1.5 ml吐温-80。每瓶接种适量细胞，终浓度为10⁴CFU^．ml^－1。置于30℃，100 r^．min^－1摇床培养。

1．3．2药物浓度的确定及收获细胞时间的确定精确称取一定量的药品，用二甲基亚砜（DMSO）或无水乙醇溶解配成一定浓度的药液，再稀释成不同浓度。将处于对数生长期的细胞接种到含药的培养基中，以不加药物的空白培养基为阴性对照。培养细胞分别于0，2，4，6，8，10，12，24，36，48h用UV-754分光光度计在600nm下读取光密度值，以时间为横坐标，A₆₀₀为纵坐标作生长曲线；以时间为横坐标，以抑制真菌生长的百分率为纵坐标作时间抑菌曲线。从而得到细胞进入稳定期的时间（24h）及各药物抑制80%细胞生长的浓度(MIC₈₀)。因此分别以各药物的MIC₈₀作为观察药物对细胞超微结构影响的浓度，即澳洲茄胺2.5mg^．L^－1，白鲜碱50mg^．L^－1紫檀32.5mg^．L^－1和7-羟基-4′-甲氧基黄烷50mg*L^－1。

1．3．3扫描电子显微镜观察液体培养基中生长24h的空白对照组及加药组的细胞离心沉淀，吸弃上清液，标本用戊二醛和锇酸双重固定，乙醇逐级脱水，喷碳、喷金后用扫描电子显微镜观察。

1．3．4透射电子显微镜观察培养细胞（培养方法同上）离心沉淀，吸弃上清液，标本用戊二醛和锇酸双重固定，包埋、切片、铅铀染色后用透射电子显微镜观察。

2结果

2．1P. wickerhamii正常细胞的超微结构

P. wickerhamii的营养孢子和休眠孢子的超微结构不同，休眠孢子内层细胞壁较厚，淀粉粒、脂粒体累积，而膜细胞器少见。营养孢子则相反，主要为膜细胞器，如线粒体、内质网等，观察结果与Joshi报道相同^［8］（图1，2）。正常细胞的生长繁殖周期为营养孢子长大后分裂成多个子细胞，由母细胞壁所包围，之后母细胞壁破裂，子细胞散发出来，开始新的生活周期。

2．2澳洲茄胺处理组细胞的超微结构

扫描电镜下可见细胞表面有疣状突起，细胞周围有许多散落的小泡，各个细胞上的突起数目、大小不等（图3）。透射电镜可见内层细胞壁及细胞膜轮廓不清，双层膜的似原质体结构高度积累，细胞器降解（图4）。

2．3白鲜碱处理组细胞的超微结构

扫描电镜下可见细胞表面皱缩（图5），透射电镜下见细胞因生长代谢受到影响，大都停留在含多个子细胞的大的母细胞阶段，而且由母细胞所包围的子细胞的细胞壁皱缩变形，膜细胞器降解（图6）。

2．4紫檀处理组细胞的超微结构

扫描电镜观察可见细胞表面严重皱缩，透射电镜下发现内层细胞壁变薄，子细胞壁消失，膜细胞器降解（图7）。

2．57-羟基-4′-甲氧基黄烷处理组细胞的超微结构

扫描电镜和透射电镜均可见细胞壁皱折，双层膜似原质体结构累积在内层细胞壁处，类似于E. Segal等研究两性霉素B对P. wickerhamii作用的观察结果^［7］，两性霉素B引起细胞膜通透性增大^［2，3］。同时可见细胞膜破损，膜细胞器降解，线粒体膨大（图8）。