［摘要］ 目的：研究破伤风类毒素聚乳酸微球(TT-MS)的制备工艺及理化性质。方法：水/油水复乳溶剂挥发法制备微球，并测定粒径及包封率。结果：可制备包封率达90%以上的微球，改变工艺条件，可在30～300μm范围内控制微球的粒径。结论：研究了微球制备工艺的影响因素，成功地制备了疫苗微球。

［中图分类号］ R978.7［文献标识码］ A

［文章编号］ 1000-1530（2000）03-0239-05

Study on preparative conditions for polylactide

microspheres containing tetanus toxoid

HE Ying, WEI Shu-Li

(Department of Pharmaceutics, School of Pharmaceutical Sciences,

Peking University, Beijing 100083, China)

ABSTRACTObjective: To prepare and characterize polylactide microspheres containing tetanus toxoid. Methods: The vaccine was entrapped using a (water-in-oil)-in-water emulsion solvent evaporation technique. The effects of process parameters on particle size and protein entrapment were investigated. Results: It was found that microspheres with loading efficiency up to 90% could be produced and 30-300 μm in diameter could be controlled. Conclusion: This paper describes the preparation of polylactide microspheres with an entrapped vaccine, tetanus toxoid.

KEY WORDSTetanus toxoid； Polylactide； Microspheres； Technology, pharmaceutical; Particle size▲

破伤风的全程免疫需要连续3次注射疫苗，由于种种原因许多人只接受了第一次注射而没有完成全程免疫，辍种率高达70%。因此，发展疫苗的单剂量脉冲给药系统，一次注射就实现全程免疫，可以显著提高接种覆盖率，直接降低疾病发生率。制备疫苗微球可以达到减少注射次数的目的^［1］。疫苗微球的释放速率取决于载药量、聚合物相对分子质量和成分及颗粒大小。本文对聚合物相对分子质量和影响蛋白质药物包封率及粒径的制备因素进行了考察。

1材料与方法

1.1材料与仪器

精制破伤风类毒素(TT, 2 200 Lf·ml^－1，卫生部北京生物制品研究所)；聚乳酸(polylactide, PLA; 相对分子质量7 000,10 000,20 000,25 000,30 000,35 000,40 000,山东省医疗器械研究所)；聚乙烯醇(PVA)17-88(北京有机化工厂)；牛血清白蛋白(BSA)、十二烷基硫酸钠(SDS)、BCA(二辛可宁酸，Bicinchoninic acid)试剂(Sigma)；其它试剂均为分析纯。

JC-3超声处理机（通化市超声设备厂）；THZ88-1型多用途台式振荡器（江苏省太仓鹿河电讯器材厂）；721分光光度计（上海第三分析仪器厂）；PMC-1型直流恒速搅拌器（北京大学京医科技开发公司）；热分析仪DSC-7（美国P-E公司）。

1.2实验方法

TT-MS制备：将90 μl TT加至1 ml含0.2 g PLA的有机相中，分散制初乳，然后将该乳液在搅拌转速为900 r·min^－1的条件下加至1mlPVA水溶液（10g·L^－1）中，乳化3min（室温），再加至外水相中，继续搅拌4h使有机溶剂挥发完全，所得微球在滤器上抽滤收集，用冷蒸馏水洗涤5次，真空干燥72h。

粒径大小及分布测定：用显微计数法从测得的150个粒径数据计算其分布的百分数、均径（表1）。

微球形态学：用显微镜和扫描电子显微镜研究微球的形态。

含量测定^［2］：准确称量20mg微球，在1ml NaOH(0.1mol·L^－1)含SDS(50g·L^－1)溶液中振荡24h，用BCA分析法^［3］测定上清液蛋白质含量。

差示扫描量热法（DSC）：取空白微球、空白微球-TT机械混合物及载药微球样品7～8mg，0～300℃，升温速率20℃/min，测定微球的热行为。

表1TT-MS（相对分子质量20 000，乳化转速1 500 r·min^－1）粒径大小及分布

Table 1Sizes and distributions results of TT-MS(MW.20 000,speed of rotation 1 500 r·min^－1)

Diameter

ranges

X₁－X₂(μm) d(Extents)

/μm d(Mid-values)

/μm Frequencies

N Percentages

dJ(%) XdJ 30-45 15 37.5 16 10.67 400.1 45-60 15 52.5 82 54.67 2870.2 60-75 15 67.5 31 20.67 1395.2 75-90 15 82.5 21 14.00 1155.0 ΣN=150 ΣdJ=100 ΣX dJ=5820.5

d, diameter；average diameter D=ΣX dJ/ΣdJ=58.2.

2结果

2.1含量测定标准曲线

用NaOH/SDS作溶剂，精确配制不同质量浓度(50,100,150,200,250,300 mg·L^－1)的蛋白质标准溶液，用BCA分析法测定吸收度，将相应数据回归并制作标准曲线。蛋白质质量浓度在50～300mg·L^－1范围内呈现良好的线性关系，标准曲线A=0.001C+0.019，相关系数r=0.998 8，临界值r_1-0.01(4)=0.917，r＞r_1-0.01(4)，相关性极显著（α=0.01)。

2.2微球制备工艺的影响因素

制备微球所用的PLA相对分子质量范围是7 000～40 000，分别制备各相对分子质量的微球，以下结果均有一致的规律性，结果以相对分子质量20000的PLA微球为代表来说明。

2.2.1乳化转速的影响依微球制备方法中各项，固定其它条件，只将乳化转速按600, 900, 1 200, 1 500 r·min^－1依次变化，测定相应条件下所得微球的含量和粒径（表2）。其中包封率＝实际含量/加入量。

2.2.2PVA质量浓度的影响依微球制备方法中各项，固定其它条件，只将PVA质量浓度按5, 10, 20, 30 g·L^－1依次变化，测定相应条件下所得微球的含量和粒径（表3）

2.2.3有机相／水相相比的影响依微球制备方法中各项，固定其它条件，只将有机相／水相相比按1/1, 1/2, 1/3依次变化，测定相应条件下所得微球的含量和粒径（表4）。相比是1/1，微球形态好，呈球形；相比是1/2，微球有椭球形；相比是1/3，微球有较多椭球形，球壁有缺损。

2.2.4有机相中PLA质量浓度的影响依微球制备方法中各项，固定其它条件，只将有机相中PLA质量浓度按50、100、200 g·L^－1依次变化，测定相应条件下所得微球的含量和粒径（表5）。

表2乳化转速对PLA微球性能的影响

Table 2Influences on properties of microspheres by speed of rotation

Speed of

rotation

(n/r·min^－1) Quantities

added in

(%) Quantities

determined

(%) Loading

efficiencies

(%) Average

diameters

(d/μm， ±s) 600 1.20 0.66 54.87 170.7±43.6 900 1.20 0.81 67.94 149.9±35.0 1 200 1.20 0.84 70.18 126.6±25.1 1 500 1.20 0.64 53.56 58.2±11.4

n, rotational fregnency; d, diametor.

表3PVA质量浓度对PLA微球性能的影响

Table 3Influences on properties of microspheres by mass concentrations of PVA

ρ(PVA)/g·L^－1 Quantities

added in

(%) Quantities