［摘要］ 目的：构建肌肉高表达质粒VR/TPO，将其在体外定量表达，并初步了解其体内表达活性。方法：以重组TPO cDNA为目的基因，构建人VR/TPO高效表达质粒，用脂质体法将其转染CHO 细胞，RT-PCR法检测mRNA表达，ELISA法检测TPO的表达量，并注入体内了解其对巨核系造血的影响。结果：VR/TPO可在CHO中高效表达，其表达量超过pcDNA3TPO,并初步发现有促进血小板增加作用。结论：VR/TPO为一高效表达TPO质粒，在体内外都有一定表达活性。

［中图分类号］ R979.5［文献标识码］ A

［文章编号］ 1000-1530（2000）03-0269-03

Transfection and expression of VR/TPO gene in vitro and in vivo

WEI Xu-Dong, FU Shuang, HAN An-Ping, WU Sha-Sha,

CHENG Kang, WANG Shen-Wu, WANG De-Bing

(Institute of Hematology, People's Hospital, Peking University, Beijing100044)

ABSTRACTObjective: To obtain the construct of cDNA TPO, in order to transfer and express it in CHO cell and Balb/c mouse. Methods: The eukaryotic muscular expression vector VR1012/TPO was constructed with human recombinant TPO cDNA as the therapy gene to transfect the CHO cell and directly inject it to BALB/C mouse. Results: CHO cells could be transferred with VR/TPO and highly express TPO protein. VR/TPO was found to promote megakaryocytics in BALB/C mouse. Conclusion: VR/TPO is a good vector to express TPO protein and also can be given directly by muscular injection.

KEY WORDSThrombopoietin； Gene transfer； Gene expression； Plasmids; CHO cells▲

基因治疗常用的载体有病毒载体和非病毒载体^［1］，肌注质粒DNA是一种简单有效的非病毒载体基因治疗方法，在临床上已成功地用于流感疫苗和乙肝疫苗等基因疫苗的预防接种，得到理想效果，而用于造血因子促血小板生成素(thrombopoietin,TPO)的导入却未见报道，现将骨骼肌高表达质粒VR/TPO的体外和动物体内表达的初步结果报告如下。

1材料与方法

1．1VR/TPO的构建

从PUC118TPO上切下TPO cDNA片段^［2］,此片段为全长TPO基因序列，1060bp,经PEGM-7Zf载体亚克隆后，导入VR1012质粒,VR1012质粒4.9kb,为骨骼肌高表达质粒，由美国Vical公司Manthorpe教授惠赠^［3］,构建成所需的VR/TPO质粒。

1．2VR/TPO质粒的大量提取

用醋酸铵法提取VR/TPO质粒^［4］，因筛选标志为卡那霉素抗性基因，因此Luria-Bertani培养基中加入50mg·L^－1的卡那霉素。

1．3VR/TPO转染CHO细胞

CHO细胞为本室冻存复苏而来。转染试剂脂质体DOTAP为宝灵曼公司产品，货号NO181177 。转染方法：CHO细胞用DMEM完全培养基培养，转染前一天传代，次日细胞达70%融合，分别转染VR1012，VR/TPO，pcDNA3TPO质粒各5 μg，每个样品与DOTAP 30 μl混匀，37℃，5%(体积分数)CO₂转染9h，后吸弃原培养基，继续培养72h。

1．4转染产物的鉴定

1.4.1RT-PCR检测转染细胞的mRNA的表达总RNA提取用Trizol试剂盒，详见说明书。逆转录反应体系：RNA 2 μl，MMLV 1 μl， DTT 2 μl,Rnasin 0.5 μl， dNTP 2 μl，随机引物1 μl,缓冲液4 μl,5倍稀释，混匀，37℃，1 h。PCR: 引物借助NBI之 Oligo primer analysis software, version 5.0 for windows 设计，委托Cybersyn公司合成，其互补DNA序列在TPO cDNA 中结合位置在161～657bp。TPO上游及下游引物为5′-ACCCCTTTGCCC-

TACACCTGTC-3′,及5′CAGAAGCCCAGAGCCC-

AGTA-3′扩增产物片段为497 bp(β-actin作为内参照，扩增产物为300 bp片段。体系：Taq酶0.3 u,上下游引物各2.0 μl，缓冲液2 μl，10倍稀释，反转录产物2μl,dNTP 2.5μl。PCR反应：94℃变性45s，58℃退火45s，72℃后延伸5min。

1.4.2酶标双抗体夹心法定量检测TPO表达应用Quantikine Human TPO Immunoassay 试剂盒 (R&D公司试剂盒编号DTPOO)。每孔加入检测稀释液RD1-20 50 μl,待测标本200 μl,充分混匀，4℃孵育3h。漂洗缓冲液充分漂洗4次。每孔中加入TPO结合物200μl,4℃孵育1h,漂洗缓冲液充分漂洗4次,每孔中加入底物液200μl，室温孵育30min，每孔中加入中止液50μl，混匀。30min内450nm测定OD值。

1.4.3MTT法检测表达TPO的活性用含10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养HEL细胞(HEL细胞为本室保存)，用培养物表达产物上清刺激HEL细胞系增殖。

1.5动物实验

BALB/C小鼠购自本校实验动物中心，6～8周龄。实验分组：(1)对照组，6只，肌注VR1012质粒100 μg；(2)实验组1， 6只，每次注射VR/TPO 100 μg；(3)实验组2， 6只， 分3次肌注300 μg VR/TPO。注射方法：胫前肌肉多位点(＞4个)，注射方向与肌纤维垂直，肌注前按摩局部肌肉。

2结果

VR/TPO质粒的酶切鉴定结果经过EcoRⅠ,XbaⅠ酶切，证明为VR/TPO质粒(图1)。

RT-PCR检测mRNA表达结果见图2。VR1012 ，PcDNA3TPO 及VR/TPO转染细胞均可见318 bp的β-actin扩增产物，但仅pcDNA3TPO和VR/TPO转染细胞可见约500 bp扩增条带,提示转染导入细胞在 mRNA水平表达。

1， λDNA/HindⅢ markers； 2， VR/TPO/XbaⅠ； 3， VR/TPO/XbaⅠ+EcoRⅠ; 4, TPO cDNA; 5, VR/TPO plasmid.

1VR/TPO酶切鉴定结果

Figure 1Restriction analysis of VR/TPO

TPO的表达定量检测，亲本CHO细胞和转染VR1012的细胞为0，VR/TPO为2 400 ng·L^－1,pcDNA3TPO为1100ng·L^－1。

Lane 1, PGEM-7Zf(+)/HaeⅢ markers； Lane2， transfected CHO with VR1012; Lane 3, transfected CHO cells with VR/TPO; Lane 4, transfected CHO cells with PcDNA3TPO.

2RT-PCR检测VR/TPO在CHO细胞瞬时表达

Figure 2RT-PCR examination of the transient expression

of VR/TPO in CHO cells

MTT检测定性表达结果发现VR/TPO,pcDNA3TPO光密度明显高于VR1012组，表明有活性TPO生成。其光密度值分别为0.23,0.15,0.005。

肌注小鼠引起的血小板升高反应，对照组肌注前血小板计数为(24.2±3.5)×10⁹L^－1,肌注后为(28.3±5.8)×10⁹L^－1 (P＞0.05)。实验组1:肌注前为(29.2±4.4)×10⁹ L^－1肌注后(32.6±6.3)×10⁹L^－1 (P＞0.05)。 实验组2:肌注前为（28.7±4.5)×10⁹L^－1肌注后为(48.2±6.3)×10⁹L^－1(P＜0.05)。

3讨论

临床上肿瘤和白血病化疗均可引起严重的血小板减少，从而引起机体严重的出血并发症，血小板输注可取得疗效，但血小板不易保存，且来源有限，长期输注会引起机体产生抗体，因此应用TPO治疗有望成为最有效的治疗手段之一。TPO制作工艺复杂，价格昂贵，应用受到限制，TPO基因的克隆成功，使人们想到TPO的基因治疗。目前关于TPO的基因治疗报道较少。这是由于TPO可以使机体产生中和抗体，甚至有报道TPO能引起白血病细胞增殖。如果表达过量还会导致骨髓纤维化，骨硬化等副作用。基因治疗的载体有病毒载体和非病毒载体，非病毒载体中直接肌注质粒DNA为基因治疗的简便有效的方法，不会像病毒那样激活诱发机体对载体发生免疫反应，不易合到基因组DNA中，而且制备过程较病毒载体简便^［5］，但也有需要质粒量多、表达不稳定等缺点。VR/TPO是由VR1012载体与TPO cDNA 片段构建而成，而VR1012来源于V1J, V1J是真核细胞表达载体，其带有CMVIE1启动子/增强子。BGH多聚腺苷信号，能在骨骼肌细胞中高产量表达。VR1012是将V1J的氨苄青霉素抗性改为卡那霉素抗性基因。

本文用VR/TPO瞬时转染CHO细胞对其进行mRNA水平的鉴定和蛋白质水平的定量和定性鉴定，结果发现TPO表达达2 400 ng·L^－1，比真核高效表达质粒pcDNA3TPO高一倍多（pcDNA3表达量为1100ng·L^－1），说明VR／TPO为高效表达载体。直接将VR/TPO给小鼠肌注，结果<