［摘要］目的:探讨Gd³⁺对大鼠和小鼠腹水巨噬细胞、小鼠腹水肝癌H₂₂细胞和人肝癌细胞BEL-7402 的生长过程的影响。方法：用LKB-2277量热活性检测仪测定37℃时细胞在加和不加Gd³⁺的介质中的产热过程的差异。结果：1.0×10^－4 mol^．L^－1 Gd^3＋对4种细胞的代谢开始都有明显促进,70min时达到产热高峰。虽然总热效应都有增加,但是癌细胞增加的比值明显小于巨噬细胞的。结论：本实验中,在初始时Gd^3＋可以促进4种细胞的产热,从热效应曲线变化推测Gd³⁺离子可能在后期使癌细胞损伤,活性降低。

［中图分类号］ R977.5［文献标识码］A［文章编号］ 1000-1530（2000）03-0207-03

Effects of Gadolinium on the growth of macrophages

and cancer cells observed by microcalorimetry

HONG Feng，LU Jing-Fen，Gulinuer，TAN An-Min，WANG Kui

（National Research Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs,

Peking University,Beijing100083, China）

DONG Xiao-Min，SU Ya-Xian

（Department of Cell Biology）

ABSTRACTObjective: To study the effects of gadolinium on the growth of macrophages and cancer cells. Methods: LKB-2277 microcalorimeter was used to measure the different processes of heat production during cell metabolism which administrated with or without Gd³⁺ at 37℃. Results: 1.0×10^－4 mol^．L^－1of Gd³⁺ promoted the metabolism of all experimental cells at the beginning, and it reached the highest value in about 70min. However, the increasing ratio of heat production of cancer cells was smaller than that of macrophages. Conclusion:Under our experimental conditions, Gd³⁺ can increase the heat production of all four kinds of cells at the beginning. From thermogenesis curves we speculate that Gd³⁺may damage cancer cells and decrease their activities in the later stage.

KEY WORDSGadolinium/pharmacol; Macrophages/drug eff; Tumor cells, cultured/drug eff; Calorimetry; Carcinoma, hepatocellular▲

最近Mizgerd等^［1］报告稀土离子能够促进巨噬细胞凋亡。王玺等^［2］发现氯化铈和氯化钆能诱导大鼠皮肤成纤维细胞凋亡。 稀土离子诱导细胞凋亡的机制虽然还不清楚, 但是已经发现LaCl₃或CeCl₃与PAMC82胃癌细胞温育能够促进p53, p16(MTS1)和p21(WAF1)的表达^［3］。有意义的是人们在研究中发现，稀土离子在能促进正常细胞生长的浓度下,促进癌细胞凋亡^［4］。基于以上结果,稀土能否有选择性地促使癌细胞凋亡, 以及稀土能否促进正常细胞生长而不对或少对癌细胞的生长表现促进作用, 便成为一个重要问题。我们用量热法测定细胞生长过程中代谢产生的热效应,以揭示Gd^3＋对正常巨噬细胞和癌细胞生长和死亡的影响。结果表明Gd³⁺对这些细胞株的热代谢在初期都有促进。相对地促进癌细胞热产生的作用较小, 但后期有促进癌细胞损伤和死亡的可能。

1材料与方法

1.1试剂和材料

氯化钆储备液的配制,加热溶解氧化钆(99.99%，北京化工厂)于5 mol·L^－1盐酸， 然后加热赶去多余HCl，用EDTA二钠盐溶液滴定钆的浓度。在所用的温育溶液中钆的终浓度为1.0×10^－4mol·L^－1。

细胞培养介质：RPMI 1640 (Gibco), 含100 IU·ml^－1青霉素,100 IU·ml^－1链霉素和10%(体积分数)小牛血清。量热实验温育介质：Hepes缓冲溶液, 含140 mmol·L^－1 NaCl, 5mmol·L^－1 KCl, 1mmol·L^－1 MgCl₂, 5.5 mmol·L^－1葡萄糖,10mmol·L^－1 Hepes, pH7.4。所有试剂均为分析纯。

1.2细胞的分离

昆明小鼠(30 g)和Wistar大鼠(250 g)购自北京大学医学部实验动物科学部(No.1999-005)。巨噬细胞是从腹腔注射1%(质量百分比)蛋白胨生理盐水溶液12 h后的小鼠和大鼠腹水中分离的(分别表示为Mφ1和Mφ2)，在4℃下用生理盐水离心洗细胞3次后进行实验。肝癌细胞是从接种H₂₂细胞株3 d后的小鼠腹水中分离的，同样洗涤3次。人肝癌细胞株BEL-7402来自北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室药理室。进行量热测定的细胞悬液的细胞浓度约为每毫升10⁶个细胞。

1.3实验方法

微量量热法测定细胞的放热过程。用LKB-2277 (Thermometric,Jarfalla, Sweden)量热活性检测仪测定在37℃,细胞在加和不加1.0×10^－4mol·L^－1Gd³⁺的介质中的产热过程。按照文献［5，6］方法进行测定和数据处理。900μl细胞悬液加100μl 1.0×10^－3mol·L^－1Gd³⁺（对照组加等体积的生理盐水)移入3ml玻璃安瓿中混匀，密封，然后将安瓿放入量热计。开始记录以前的滞后期大约50min。单个细胞产热量C⁰用产热曲线的峰值h除以细胞总数，单位是pW/cell （10^－12 W/cell）。在测量过程中总热效应C（nJ，即10^－9焦耳）由产热曲线积分面积求得，每组实验重复3次。

2结果与讨论

图1，2给出两种细胞Mφ1和H₂₂在有Gd³⁺(1.0×10^－4mol·L^－1)和无Gd³⁺的介质中温育过程中的产热曲线。其余Mφ2和BEL细胞的产热曲线分别与Mφ1和H₂₂有相似的变化趋势。从产热曲线计算出的C和C⁰列入表1中。

图1小鼠巨噬细胞Mφ1在有Gd³⁺(b)

和无Gd³⁺(a) 的情况下的产热曲线

Figure 1Thermogenesis curves of mouse macrophage

activated with (b) or without (a) Gd³⁺

图2小鼠腹水肝癌细胞H₂₂在有Gd³⁺ (b)

和无Gd³⁺(a)的情况下的产热曲线

Figure 2Thermogenesis curves of H₂₂ cells activated

with (b) or without (a) Gd³⁺

由产热曲线可见加入Gd³⁺在起始时对几种细胞热代谢都有明显的增强作用。与对照相比Gd³⁺使巨噬细胞代谢加速, 产热迅速增长。小鼠巨噬细胞比大鼠巨噬细胞的总热效应略大。这一差别可能与Singer等^［7］所证明的哺乳动物体重越大, 血的基础代谢率越低有关，但是Gd³⁺激活这两种巨噬细胞所造成的产热增长比值基本相同 (分别为8.4和8.5)。相比之下,两种癌细胞在无Gd³⁺时产热都较高，反映生长代谢速度比巨噬细胞快，而且BEL细胞比H₂₂细胞基础产热量略高。不过癌细胞中加入Gd³⁺后总热效应增加比值比巨噬细胞的小, 但是两种癌细胞总热效应的增长比值基本相同 (分别为2.25及2.31)。

从Mizgerd^［1］的结果可见, 巨噬细胞对于稀土离子的应答起始于吞噬作用, 然后导致细胞凋亡。另外有报告指出稀土离子在低浓度下促进吞噬作用^［8］。图1产热曲线表明这一过程中的热效应, 即开始吞噬作用的增强, 达到高峰后曲线迅速下降回到基础代谢水平。 两种癌细胞的热代谢同样也被Gd³⁺所促进, 在起始阶段以高速度增长, 只是达到高峰后迅速下降甚至低于对照，这可以解释为Gd³⁺对癌细胞生长的抑制作用。

表1在有1.0×10^－4mol·L^－1 Gd³⁺

和无Gd³⁺的介质中细胞的热效应参数(n=3)

Table 1The calorimetric parameters of cells activated

with or without gadolinium ions（n=3)

C⁰ and C Heat production rate

(pW/cell) Total heat effect

(nJ/cell) Mφ1 1.67±0.38 5.0±0.9 Mφ