［摘要］目的：从癌细胞增殖、凋亡和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs) 的分泌等方面研究层粘连蛋白总糖肽(laminin-glycopeptides, LN-GPs) 抗癌细胞转移的机制。方法：将人肝癌细胞系Bel7402细胞于层粘连蛋白基质上孵育一定时间后，噻唑蓝比色法测活细胞群体总数。³H-TdR参入法测癌细胞DNA的合成；荧光素活化的细胞分拣术(fluorescent activated cell sorting, FACS)测定细胞周期；细胞经吉姆萨染色后计数有丝分裂指数；FACS和丫啶橙染色法检测细胞的凋亡。明胶酶谱分析法检测无血清培养上清中癌细胞分泌MMPs的水平。糖肽组加LN-GPs (50 mg^．L^－1）。结果：癌细胞孵育后，活细胞群体总数增加，³H-TdR的参入升高，G₁期细胞减少而S期细胞增加。相反，加LN-GPs组活细胞群体总数明显降低，³H-TdR的参入下降，G₁期细胞增加而S期细胞减少，与未包被组结果相近。但两种方法均未检测到明显的癌细胞凋亡。LN-GPs组人肝癌细胞系Bel7402细胞和高转移潜能的人巨细胞肺癌细胞系PG细胞的MMPs分泌和活化明显降低。结论：LN可促进癌细胞的增殖，而LN-GPs能抑制这一作用，并可明显抑制癌细胞MMPs的分泌，这可能是其抑制癌细胞侵袭和转移的重要环节。

［中图分类号］R979.1［文献标识码］ A

［文章编号］ 1000-1530（2000）03-00258-04

Further studies on the anti-metastasis mechanism of Laminin-glycopeptides

LU Yan-Yan, ZHOU Rou-Li, ZHANG Sha, JIANG Xin-Nong

(Department of Cell Biology, School of Basical Medical Sciences,

Peking University, Beijing100083, China)

ABSTRACTObjective: To further study the mechanism of anti-metastasis effects of laminin-glycopeptides (LN-GPs) on carcinoma cell proliferation, apoptosis and secretion of matrix metalloproteinases (MMPs). Methods: Human hepatocellular carcinoma (HCC) cell line Bel7402 cells in serum free medium were incubated on laminin (LN) coated substrate for indicated time with or without LN-GPs at the final concentration of 50 mg^．L^－1. The total number of survival cells after incubating for 24, 48, 72 and 96 hours was assayed by MTT method. DNA synthesis of the incubated cells was analyzed by³H-TdR incorporation. Cell cycle was analyzed by FACS (fluorescent activated cell sorting, FACS). Mitotic index of Giemsa stained cells was counted. Carcinoma cell apoptosis was detected by both FACS and acridine orange (AO) staining methods. MMPs secretion of incubated cells was analyzed by gelatin zymography. Results: The total number of survival carcinoma cells incubated on LN was significantly larger than that on uncoated substrate. LN could promote HCC cell DNA synthesis as shown by³H-TdR incorporation, decrease the percentage of carcinoma cells in G₁ phase and increase the percentage of carcinoma cells in S phase as shown by FACS. In contrast, LN-GPs could inhibit the effect of LN by inhibiting carcinoma cell³H-TdR incorporation, increasing the percentage of carcinoma cells in G₁ phase and decreasing the percentage of carcinoma cells in S phase. MMPs secretion of carcinoma cells on LN in the presence of LN-GPs was much less compared with that of cells on LN alone. Conclusion: LN could stimulate carcinoma cell proliferation. LN-GPs could significantly inhibit the effect by inhibiting DNA synthesis and could inhibit the secretion of MMPs of carcinoma cells, which might contribute to their decreased invasive and metastatic phenotype.

KEY WORDSLaminin/pharmacol; Glycopeptides/pharmacol; Neoplasm metastasis/drug ther▲

层粘连蛋白 (laminin, LN) 是一种高度糖基化的大分子非胶原糖蛋白，是特化的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)——基膜的特有成分。在细胞表面受体的介导下，LN可以影响癌细胞的多种生物学行为。一定的糖链结构是LN与LN受体之间识别和结合的分子基础^［1］。本室以往的研究表明，从LN中分离的总糖肽(laminin-glycopeptides, LN-GPs)以及依据LN-GPs之有效结构设计并人工合成的两种寡糖可抑制小鼠黑色素瘤细胞的实验性肝转移和/或实验性肺转移^［2，3］，LN-GPs可以抑制癌细胞在LN基质上的粘附、铺展、迁移和侵袭等转移相关行为^［4］。本文进一步研究LN-GPs对癌细胞在LN基质上增殖、凋亡及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)分泌的影响，以进一步揭示其抗转移的分子机制。

1材料与方法

1.1材料

人肝癌细胞系Bel7402和人胃癌细胞系BGC-823由北京师范大学引进。高转移潜能的人巨细胞肺癌细胞系PG由本校病理学系提供。细胞均在含10%(体积分数)小牛血清的完全RPMI-1640培养基，5%(体积分数)的CO₂中，于37℃培养。

LN由本室自小鼠Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 瘤制备，为LN-1；LN-GPs由本室自LN制品制备，根据中性糖含量定量。RPMI-1640培养基干粉为GibcoBRL公司产品；MTT［3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyl tetrazolium bromide］为Sigma公司产品；³H-TdR购自中科院上海核能研究所。其它试剂为国产分析纯或优级纯。

1.2方法

LN基质的包被：参见文献［1］。对照组除不加LN外其余处理同LN组。通过LN-GPs对细胞粘附的抑制作用确定本批LN-GPs的有效质量浓度为50mg*L^－1。

MTT法检测活细胞群体总数：将单细胞悬液台盼蓝排斥法测细胞活率＞95%。细胞用无血清RPMI-1640洗3遍后，以每毫升10⁵个细胞，每孔100 μl接种于96孔板中培养。MTT的检测方法参见文献［5］。每24h测定1次，设4复孔取均值。

³H-TdR参入法检测细胞的DNA合成：将单层培养细胞消化后制成单细胞悬液，以每孔10⁴个细胞接种至24孔板培养。24 h后每孔加³H-TdR 5μBq继续培养24 h。将细胞用PBS充分漂洗后收集于玻璃滤纸上，液体闪烁仪上测其每分计数值。设4复孔取均值。

荧光素活化的细胞分拣术(fluorescent activated cell sorting, FACS)分析细胞周期：细胞在LN基质上、加或不加LN-GPs的条件下培养48 h后制成单细胞悬液，经RNA酶消化，碘化丙啶染色后，流式细胞仪上检测单细胞DNA的含量，分析不同周期时相的细胞数。

细胞有丝分裂指数的测定：细胞在包被LN的盖玻片上，在加或不加LN-GPs的条件下培养48 h，细胞爬片经甲醇冰醋酸固定、吉姆萨染色后下计数每1 000个细胞中有丝分裂期细胞的百分数。

FACS和丫啶橙染色法检测细胞的凋亡：按细胞周期分析的方法处理细胞，于流式细胞仪上检测细胞的凋亡峰。丫啶橙染色法时按有丝分裂指数的方法做细胞爬片，经酒精固定及1 g*L^－1的丫啶橙染色后，蓝光激发下荧光显微镜下计数凋亡细胞。

明胶酶谱分析、细胞MMPs分泌见文献［6］。

2结果

2.1LN和LN-GPs对人肝癌细胞系Bel7402细胞活细胞群体总数的影响(图1)

MTT检测结果显示在无血清条件下，细胞在LN基质上培养24～96h后的活细胞群体总数明显高于未包被LN基质的对照组，培养72h活细胞群体总数达到峰值；而糖肽组者明显低于LN组，与对照组相近，以48h的差别最为明显。表明LN基质对无血清培养的Bel7402细胞具有明显的促增殖作用；而LN-GPs可以明显抑制LN的这一作用。

2.2³H-TdR参入实验的结果

Bel7402细胞孵育48 h后，未包被基质对照组、包被LN基质组和加LN-GPs组的平均每分计数值分别为2 645±134，3 661±231和2 856±202。LN基质组细胞的³H-TdR参入量高于未包被基质的对照组约38.4%(P＜0.01)。而LN-GPs可以使参入率降低21.9%(P＜0.05)。与MTT的结果一致。

2.3FACS对细胞周期的测定结果(表1)

与未包被的对照组相比，在LN基质上孵育48 h后，Bel7402细胞处于G₁期的比率由(68.0±3.3)%降为(52.4±2.4)%，S期细胞的比率由(19.0±2.1)%增加到(34.2±3.8)%；同样BGC823细胞G₁期比率由(74.0±8.2)%降为(63.3±7.9)%，S期细胞的比率由(17.7±3.0)%增加到(27.6±4.2)%。各组间相比差异均有极显著意义(P＜0.01)，而加LN-GPs组Bel7402细胞和BGC823细胞G₁期的比率均增加，分别为(66.7±9.4)%和(74.5±8.3)%；S期比率下降，分别为(21.2±3.0)%和(16.9±3.1)%，与未包被组各期分布相似