［摘要］ 目的：研究表面修饰对载环孢菌素A纳米粒体外细胞吞噬和体内组织分布的影响。方法：用³H-环孢菌素A制备了平均粒径为59 nm的聚乳酸纳米粒，采用物理吸附的方法分别用Brij 78、Myrj 53和Myrj 59 3种表面活性剂对其进行了表面修饰。以小鼠腹腔巨噬细胞为体外细胞模型，以一级昆明种小鼠为动物模型，分别做体外细胞吞噬实验和体内组织分布实验。结果：纳米粒组可使小鼠腹腔巨噬细胞对环孢菌素A的摄取值达溶液组的20倍，表面修饰可使小鼠腹腔巨噬细胞的摄取值明显减小。纳米粒组可使环孢菌素A在小鼠肝、脾的组织分布相对于环孢菌素A溶液组明显增加，表面修饰可使环孢菌素A在小鼠肝、脾的组织分布有不同程度的增加。结论：表面修饰可以显著改变载环孢菌素A聚乳酸纳米粒的体外细胞摄取和体内在网状内皮系统的组织分布。

［中图分类号］ R978［文献标识码］ A

［文章编号］ 1000-1530（2000）03-0235-04

Effect of surface modification on the uptake of polylactic acid nanoparticles

loading cyclosporine A by cells in vitro and on the body distribution in vivo

WANG Jie，ZHANG Qiang，YI Xiang，LI Hong-Shan，WEI Shu-Li

（Department of Pharmaceutics,School of Pharmaceutical Sciences,

Peking University, Beijing100083, China）

CAO Dong

（Department of Pharmacology,School of Pharmaceutical Sciences,

Peking University, Beijing100083, China）

ABSTRACTObjective: To investigate the effect of surface modification on the uptake of cyclosporine A loaded nanoparticles by cells in vitro and on the body distribution in vivo. Methods: The polylactic acid nanoparticles with a mean diameter of 59 nm were prepared with³H-labelled cyclosporine A and then three surfactants: Brij 78, Myrj 53 and Myrj 59 were used to modify the surface of the nanoparticles by physical adsorption. The mouse peritoneal macrophages and 35 mice were used to investigate the uptake of nanoparticles by cells in vitro and body distribution in vivo respectively. Results: In in vitro experiment, a 20-fold increase of cpm value in mouse peritoneal macrophages was observed in cyclosporine A nanoparticles compared with that in the cyclosporine A solution. Surface modification was found to reduce the uptake of nanoparticles. In in vivo body distribution, a noticeable increase of cpm value in reticuloendothelial system (RES) was observed. Conclusion: Surface modification effectively altered the uptake of cyclosporine A loaded polylactic acid nanoparticles by cells in vitro and the body distribution in vivo.

KEY WORDSDrug carriers; Nanoparticles; Cyclosporines/pharmacokin; Macrophages, peritoneal; Phagocytosis▲

药物载体输送系统——主要指微球、纳米粒(nanoparticles, NP)、脂质体等亚微粒的研究已成为药剂学研究中非常活跃的领域， 在静脉给药时药物

载体输送系统亚微粒易被体内免疫系统的吞噬细胞作为异物而识别和吞噬，这些吞噬细胞主要为单核吞噬细胞系统(mononuclear phagocyte system, MPS)，网状内皮系统(reticuloendothelial system, RES)中的肝和脾在吞噬这些亚微粒方面起了重要作用。如何减少或避免载体输送系统亚微粒在体内对吞噬细胞的趋向性及延长其在体内的循环时间；成为近年来的一个研究热点，其中对纳米粒进行表面修饰的研究日益活跃^［1］。环孢菌素A(cyclosporine A, CyA)是一种具有强大免疫抑制作用的由11个氨基酸组成的环状多肽，CyA可以抑制巨噬细胞产生白细胞介素-1而产生免疫抑制作用^［2］，因而研究巨噬细胞对载CyA纳米粒的吞噬摄取具有重要意义。本文以³H-标记的环孢菌素A(³H-CyA)制备了聚乳酸纳米粒(³H-CyA-NP)，采用物理吸附的方法用Brij 78(polyoxyethylene 20 stearyl ether)、Myrj 53(polyoxyethylene 50 stearate)和Myrj 59(polyoxyethylene 100 stearate)3种表面活性剂分别对³H-CyA-NP进行了表面修饰，以小鼠腹腔巨噬细胞(mouse peritoneal macrophage, MPM)为细胞模型，以一级昆明种小鼠为动物模型，研究表面修饰对载环孢菌素A聚乳酸纳米粒体外细胞摄取和体内分布的影响，并考察体外巨噬细胞对纳米粒的摄取与体内纳米粒对RES靶向作用的相关性。

1材料与方法

1.1实验材料和仪器

³H-CyA(放化纯度大于90%，比放射强度1.85×10¹⁵Bq·mol^－1)，中国原子能科学研究院标记；聚乳酸(MW 1500)，山东医疗器械研究所；普朗尼克F₆₈、Brij 78、Myrj 53和Myrj 59, Sigma公司； Triton X-100, FARCO Chemical Supplies, Hong Kong；PPO(2,5-Diphenyloxazole), Fluka 公司；分析纯过氯酸，天津市东方化工厂；分析纯双氧水，北京化工厂；二甲苯，北京益利精细化学品有限公司。

液闪计数仪：Parmacia WALLAC 1410(Turku, Finland);粒径测定和分析仪：Submicron Particle Sizer(Model 370, Santa Barbara, California, USA)。

一级昆明种小鼠由本校实验动物部提供。

1.2载CyA聚乳酸纳米粒的制备

在50 ml无菌三角瓶中加入³H-CyA乙醇溶液0.36ml(3.7×10¹⁰Bq·L^－1)，60℃水浴中以氮气吹干乙醇。在上述三角瓶中加入50 mg CyA、450 mg聚乳酸和50 ml丙酮，充分振荡，使瓶中各物质溶解,构成有机相。取普朗尼克F₆₈ 375 mg溶于150 ml注射用水中，构成水相。将有机相注入0～2℃的水相，所得半透明体系置60℃水浴中蒸发丙酮并浓缩至50 ml,即得³H-CyA-NP。用激光散射法于632.8 nm波长条件下测得此纳米粒的粒径为(59±11) nm。取该纳米粒混悬液用负染法拍透射电镜照片，观察其形态，结果见图1。

图1载环孢菌素A聚乳酸纳米粒透射电镜照片

［平均粒径（59±11） nm］

Figure 1Electron transmission microphotography of CyA

loaded nanoparticles after negative staining［（59±11） nm］

各取³H-CyA-NP 5 ml，分别加入100 mg的Brij 78、Myrj 53和Myrj 59，超声震荡5 min，即得各表面修饰的载环孢菌素A的纳米粒。

1.3MPM悬液的制备^［3］

取(20±2)g昆明一级小鼠若干只，断颈处死，在无菌操作下，每只用5 ml冷Hank's液注入腹腔，按压腹腔壁100次(1 min)，吸出腹腔液。合并腹腔液摇匀，取样进行细胞计数，用含5%（体积分数）小牛血清的RPMI-1640液稀释至每毫升1×10⁵备用。

1.4MPM的体外摄取实验^［3］

于10 ml离心管中分别加入MPM悬液1.0 ml和各样品0.5 ml，（37±0.5）℃水浴中培养30 min(每5 min振摇一次)，取出于冰浴中终止吞噬，离心(600×g,5 min)，弃去上清液。用生理盐水12 ml分次(4 ml×3)，洗涤，离心，弃去上清。其中一组只加MPM悬液1.0 ml作为细胞对照。

1.5体内组织分布实验

取(20±2) g一级昆明小鼠35只，随机分成5组，按5 mg·kg^－1环孢菌素A尾静脉给药。10 min后，断头取血0.1 ml，并取肝、脾和肾各50 mg于10 ml离心管中，消化后测定样品的每分计数值。另取一组小鼠，不给药，作为空白组织对照。

1.6液体闪烁计数的测定

闪烁液的配制：取5 g PPO，加入Triton X-100 333 ml，再加入二甲苯至1 000 ml，摇匀备用。

于各实验样品离心管中，加入过氯酸0.2 ml，双氧水0.4 ml，密塞于75℃水浴中加热2 h，加入闪烁液10 ml，摇匀，测定样品的每分计数值。

1.7统计学方法

测定结果以±s表示，采用t化极差q法检验比较各组样品的细胞摄取和体内组织分布。

2结果

2.1各样品体外细胞摄取的比较(表1)

与³H-CyA-Sol相比，³H-NP可使MPM的摄取值明显增加(P＜0.001)。与³H-NP相比，经表面活性剂修饰的各样品MPM摄取