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［中图分类号］Q343.1［文献标识码］ A
［文章编号］ 1000-1530（2000）03-0262-03
Relationship between enzyme activity and polymorphism
of the 1298th nucleotides of mthfr gene
ZHU Hui-Ping, LIU Ming-Zhu, DAO Jing-Jing, LI Zhu
(Institute of Reproductivet Health, Peking University, Beijing100083, China)
ABSTRACTObjective: To investigate the effect of the 1298AC polymorphism of mthfr gene on the specific enzyme activity and thermolability of the enzyme. Methods: Whole blood samples from 64 Chinese females were obtained for detection of genotype and enzyme activity. The genotype was determined by PCR-RFLP protocol. Enzyme activity of lymphocytes were detected routinely. Thermolability was determined by detecting residual activity after incubation at 46℃ for 5 minutes. The enzyme activity and residual acticity percentage were compared among different genotypes. Results: With the genotype of 677CC, average specific activity of normal genotype of 1298AA is 12.263 nmol CH2O/（mg protein．h）, compared with that of 9.524 nmol CH2O/（mg protein．h） of heterozygotic genotype of 1298AC and 7.830 nmol CH2O/（mg protein．h）homozygotic genotype of 1298CC. No difference of residual activity percentage among three genotypes was found. Conclusion: The 1298 A→C polymorphism may lead to reduction of the specific activity, while it does'nt affect the thermolability of the enzyme.
KEY WORDS
KEY WORDSN5,N10-methylenetetrahydrofolate Dehydrogenase/metab; Gene; Polymorphism (genetics)▲
N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(N5,N10-methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR,EC1.1.1.68) 是一种黄素蛋白，催化体内N5,N10-亚甲基四氢叶酸生成N5-甲基四氢叶酸的还原反应。近来发现，mthfr基因第677位核苷酸的多态性可引起酶活性的轻度或中度降低，这样的个体并不表现典型的临床症状，但可引起同型半胱氨酸血症（homocysteinemia）。由于同型半胱氨酸（homocysteine, HCY）是心血管疾病和一些出生缺陷的危险因素之一，mthfr基因多态性也与这些疾病的发生有关［1～3］。最近van der Put等又报道了mthfr基因的一个多态性位点，即第1298位核苷酸的多态性。当该核苷酸为腺嘌呤（A）时，编码一个谷氨酸（glutamate, Glu），如果被胞嘧啶（C）替代，则变为编码一个丙氨酸（alanine, Ala）［4］。本研究探讨了中国人mthfr基因1298A→C多态性与外周血淋巴细胞MTHFR酶活性和热稳定性的关系，现将结果报告如下。
1材料与方法
1.1外周血的采集
用K3-EDTA抗凝的负压采血管，采集肘静脉血5 ml。
1.2mthfr A1298C基因型检测
从500 μl全血提取基因组DNA。红细胞裂解液：10 mmol·L－1 Tris-HCl(pH=7.6), 5mmol·L－1 MgCl2, 1%(体积分数) Triton X-100, 0.32 mol·L－1蔗糖；白细胞裂解液：10mmol·L－1 Tris-HCl(pH=8.3), 2.5 mmol·L－1 MgCl2, 0.45%(体积分数) Tween 20, 0.45%(体积分数) NP-40, 0.1%(体积分数)明胶。
PCR反应：引物（上海Sangon公司合成）：上游：5′－CTT TGG GGA GCT GAA GGA CTA CTA C-3′，下游：5′-CAC TTT GTG ACC ATT CCG GTT TG-3′；反应体系：总体积为25μl,含1.2单位Taq聚合酶（华美）,dNTPs各100μmol·L－1,1.5mmol·L－1 MgCl2, 10mmol·L－1 Tris-HCl。反应条件：Perkin Elmer 9600型基因扩增仪：95℃预变性5min；95℃变性15s,60℃复性35s,72℃延伸15s，循环36次；72℃延伸7min。扩增产物为163bp。
限制性片段长度多态性分析：mthfr第1298位核苷酸从A到C的突变去除了一个限制性内切酶MboⅡ的识别位点。因此上述扩增产物用MboⅡ（Biolabs）酶切后进行PAGE电泳分析，以判断基因型。
1.3MTHFR酶活性检测
从5 ml外周血中常规分离淋巴细胞，冻融法裂解细胞。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，并将裂解液稀释至200 mg·L－1。250μl反应混合物中含0.3mol·L－1磷酸钾缓冲液（pH=6.8）121μl，0.05 mol·L－1 EDTA（pH=7.0）5μl，4.5mmol·L－1 FAD 3μl，0.3mol·L－1 VitK3 3μl，细胞裂解液100μl，0.28mmol·L－1 ［5-14C］甲基四氢叶酸水溶液（含48.6mmol·L－1抗坏血酸）。37℃孵育20min。在反应混合物中依次加入5μl 1mol·L－1甲醛溶液、100μl0.25 mol·L－1双甲酮和50μl 3mol·L－1醋酸钾缓冲液终止反应，将混合物沸水浴5min后，再冰浴5min，使结晶充分析出。加入3ml闪烁液（5 g·L－1 PPO,0.4g·L－1 POPOP）进行液闪计数。酶活性以每小时内每毫克蛋白所生成的甲醛的量(nmol)表示。
1.4MTHFR热稳定性的检测
细胞裂解液经46℃灭活5 min后，检测其残余酶活性。热稳定性用残余酶活性占灭活前酶活性的百分比来表示。
2结果
2.11298A→C多态性在中国人中的分布
mthfr 1298AC基因型检测电泳结果见图1。
M, marker.
1mthfr 1298AC 基因型PCR-RFLP分析结果
（200 g·L－1PAGE电泳，110 V，45 min）
Figure 1PCR-RFLP analysis of mthfr 1298AC polymorphism
（200 g·L－1 PAGE,110 V,45 min）
检测的64名中国女性中，基因型为AA者共48人，占75％，杂合型（AC）共15人，占23.4%，纯合突变型仅有1人，占1.6%。1298C在该人群中的等位基因频率为（15＋2）/64×2＝13.3%。
2.21298A→C多态性与特异性酶活性和热稳定性的关系
不同（1298A→C和677C→T）基因型特异性酶活性和残余酶活性百分比的比较见表1。
第677位核苷酸基因型相同时（如677CC），1298AA（正常型）酶活性最高，1298AC（杂合型）酶活性稍低，1298CC（纯合突变型）酶活性最低，即酶活性随着突变等位基因数增加而降低。残余酶活性百分比则无明显下降趋势。当第677位和第1298位均为杂合突变时，平均酶活性低于677CC型；当第677位为纯合突变型677TT，第1298位为杂合型1298AC时，酶活性更低。
2.31298AC基因型与677CT基因型的分布
检测的全部64份DNA样品中第677位为纯合突变（677TT）的共26例，其中25例第1298位为正常纯合型（1298AA），仅有1例为杂合型（1298AC）；第1298位核苷酸为纯合突变型（1298CC）的只有1例，其第677位为正常纯合型，即677CC。两位点均为杂合型的（1298AC/677CT）共11例，占17.2%。
表1MTHFR基因型与酶活性和残余酶活性百分比的关系(±s)
Table 1Relationship between MTHFR genotype,specific enzyme
activity and residual activity percentage(
