摘要5年来北京医科大学心血管基础研究所在国家生物高技术计划的支持下克隆了HRG-1、HCY-2、hhLIM、TFAR等6种新基因，并对其功能进行较系统的研究，发展基因缝线，病毒脂质体，电脉冲等几种新的体内转基因的方法，进行肌肉和体内基因转移，治疗实验性高血压、高胆固醇血症和梗塞性血管病等疾病，发展了多种基因药物的研究。

中国图书资料分类法分类号Q343.1

The studies of cardiovascular molecular biology

TANG Jian^＃, CHEN Guang-Hui(CHEN Kuang-Hueih), ZHOU Ai-Ru, MA Da-Long

(＃The Institute of Cardiovascular Basic Research, Beijing Medical University, Beijing100083)

MeSHGene transferGene therapyGenesClonal, molecularCardiovascular diseases/ther

ABSTRACT For the past 5 years, we have cloned six novel genes such as HRG-1, HCY-2, hhLIM, and TFAR-19 etc. and also studied the functions of these genes systemically. All this was done under the support of National Bio High Tech Project. For gene transfer, we have developed several novel gene delivery modalities for transfering genes into skeletal muscles and certain tissues, such as gene suture, gene balloon, viral-liposome complex (adenosome), electro-accupuncture, and electric pulse etc. and used them to treat experimental hypertension, hypercholesterolemia, and occlusive vascular diseases.Besides, we have started the studies of several gene medicines and got some promising results.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:481-484)

近5年来，我们所主持和承担了国家重大基础发展规划（973），国家基础发展计划（攀登计划）和国家生物高技术发展计划（863）等多项心血管分子生物学的任务。主要开展了以下几方面的研究，并取得了初步成果。

1新基因的克隆

5年来，我们建立心肌、血管平滑肌细胞、内皮细胞、胚胎心和脑的cDNA文库，应用差异显示，递减杂交、DNA Chips技术和方法，克隆出HRG-1、HCY-2、hhLIM、TFAR-19、UCK等一系列新基因^［1～5］。

1.1HRG-1基因

HRG-1基因是应用自发性高血压大鼠和正常(WKY)大鼠培养的平滑肌细胞，通过差异筛选，克隆出的一个与细胞增殖相关的基因，其全长为4.16 kb，可编码出661个氨基酸。以大鼠HRG-1 为探针，从人的肾脏cDNA 文库中，亦克隆出人的HRG-1 全长cDNA ，它与大鼠有91.8%的同源性，定位1号染色体上(1p36.3)。应用Northern blot 和免疫组织化学的方法证明，人和大鼠HRG-1广泛分布在心、脑、肾、肺、肝等不同组织中。应用荧光融合蛋白的方法发现，它可能是一种膜蛋白，主要存在于细胞膜和胞浆中。这种蛋白质可为蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)磷酸化，抑制raf和丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)的活性，因此它可以抑制一些细胞的增殖，是一种与细胞增殖相关的新的细胞内信息传递分子。

HRG-1在一些心血管病和肿瘤的发病中可能具有重要意义。在自发性高血压大鼠平滑肌细胞、内皮损伤再狭窄和去ApoE基因的动脉粥样硬化小鼠的动脉壁内低表达；转HRG-1基因或蛋白质可以抑制血管平滑肌细胞的增殖。在一些肿瘤细胞(如鳞状上皮癌，髓性白血病，卵巢癌等)细胞株，HRG-1基因低表达。应用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)证明，在一些肿瘤细胞株HRG-1基因丢失和移位，其丢失率可以达30%以上。给U937和食管癌细胞株转移HRG-1基因可以抑制癌细胞的生长和集落形成^［1，3］。

1.2hhLIM基因

hhLIM基因是应用胚胎心脏和去胎心的胚胎经三元递减所克隆的一个与心脏生长相关的新基因，其人cDNA全长为1006 bp，可编码194个氨基酸。它与LIM家属基因(RP-1,SmLIM等)有高度同源性，都是一类富含Cysteine的锌指结构的蛋白。但是与其它LIM不同，它主要分布在心肌细胞，很少在其它细胞、组织和器官中表达，因此它可能是一种特异性的心肌表达的基因。

hhLIM可能与心肌生长和心肌肥厚有密切的关系。在自发性高血压大鼠、异丙肾上腺素和主动脉夹闭所致的心肌肥厚的标本中，hhLIM高表达；应用内皮素或血管紧张素2可促进hhLIM的表达，并可诱导心肌生长；给培养的心肌细胞导入hhLIM，可以促进心肌3H-亮氨酸参入和蛋白质的合成，促进心肌细胞的生长。

1.3HCY-2基因

HCY-2是通过半胱氨酸/同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞，应用差异筛选所获得的一种新的基因，其cDNA全长为2 014 bp ，可编码 142个氨基酸。应用Northern blot和免疫组织化学证明，HCY-2广泛分布在脑、肾、心、肺、肝等不同的组织器官中。氨基酸序列分析，它可能具有两个活性基团（3～30和60～90氨基酸），与体内许多与细胞凋亡相关的丝/苏氨酸，蛋白激酶(如细胞凋亡蛋白，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor， TNF)诱导蛋白等)有高度同源性。给培养的平滑肌细胞导入HCY-2基因可以引起细胞凋亡。给鸡胚导入HCY-2基因可以引起神经管和心脏发育畸形^［2，6］。

此外，我们尚与卫生部分子免疫重点实验室合作克隆了两个与细胞凋亡相关的基因——TFAR-15和TFAR-19，和一个新的细胞趋化因子——UCK。其中UCK具有多种变异体，它可以趋化单核细胞、淋巴细胞和多形核粒细胞，促进造血干细胞和成肌母细胞的增殖^［5，7］。

2新的基因转移体系

基因转移是研究基因功能，实现基因治疗的关键。目前国际上多采用病毒介导和非病毒介导的两类基因转移方法，前者基因转移效率高，但毒副作用大；后者毒副作用小，但基因转移效率低。近年来我们发展了以下几种新的基因转移体系^{［6，8～15］}。

2.1受体介导的基因转移

我们与上海市肿瘤所合作，分别应用内皮素A型受体阻断剂(BQ₁₂₃)和B型受体阻断剂(BQ₃₀₂₀)，通过多聚赖氨酸与基因偶联，形成受体阻断剂与DNA的复合体。应用这种受体介导的复合体，直接转染血管内皮细胞和平滑肌细胞，可以明显提高基因转移效率60%～80%，并具有明显的靶向性。BQ₁₂₃-DNA复合体可以通过A型受体，特异性转移至血管平滑肌细胞；BQ₃₀₂₀-DNA复合体可以通过B型受体，特异性转染内皮细胞^{［16，17］}。

2.2病毒脂质体

由于腺病毒载体虽具有高度的转染性，但副作用大；而脂质体虽然转染效率低，却比较安全。我们应用腺病毒包被蛋白的单克隆抗体，分析了腺病毒不同包被蛋白在转染中的作用，发现腺病毒的fiber蛋白在转染中起着关键作用。因此应用蛋白质工程的方法，重组和纯化fiber蛋白质，并镶嵌在双层脂质体膜上，形成fiber蛋白脂质体，应用这种病毒脂质体(adenosome)转染平滑肌细胞，其转染效率可以从2%提高到30％～40%以上^［14］。

2.3基因缝线

1990年美国Wolff发现给肌肉直接注射裸DNA，可以进入肌细胞，表达出相应蛋白质，但转移效率低，难以达到实际应用效果。我们将手术缝线浸泡于富含阳离子的多聚赖氨酸-或明胶溶液中，吹干后带负电荷的DNA可粘附在缝线上，进行肌肉缝合。这样既可以促进肌肉的再生，提高肌肉内转基因的效率，又可以保持基因在肌肉局部，防止基因的流失，延长基因转移的时间，达到体内转基因治疗疾病的目的^［15］。

2.4电针介导的基因转移

电针介导的基因转移是在电渗透和电打孔转移技术的基础上发展起来的一种新的体内基因转移的方法。这种方法是将重组的裸DNA，粘附在针灸针上，插入肌肉内，通过脉冲方波电刺激，从而实现基因转移。亦可在肌肉内先注入重组DNA，再应用表面电极或插入肌肉局部的电极，予以电刺激。其电压强度为80～200V/cm，波宽为20～40ms，频率为1～4次。其基因转移效率比直接肌肉注射法提高了几倍至几百倍，是一种较为理想的基因转移方法。它不仅简便，易行，经济实用，而且安全、有效，可以反复应用。此外，可以实行多点、多次电脉冲基因转移，不仅可以根据个体需要，调整基因导入的用量，还可以同时携带几种不同的基因，实现多种基因的综合转移^［13］。

最近，我们还研制了一种高通量多基因的基因转移体系，应用电脉冲可以同时进行几百个基因的转移，进行大规模基因功能的筛选。

此外，我们实验室还创建了基因支架（stent）基因球束导管等血管内基因转移的方法。

3基因药物^［18］

基因药物亦称DNA药物，它是将具有治疗意义的基因重组进真核表达载体，直接转移至人体的细胞，表达出具有治疗意义的多肽和蛋白质，而达到治疗目的的一种新的方法。它与传统的蛋白质工程<