摘要目的：研究金属硫蛋白对活性氧诱导的血管平滑肌细胞增殖的影响。方法：用过氧化氢和甲萘醌分别作为内源性和外源性活性氧刺激平滑肌细胞增殖，应用细胞总蛋白定量，³H-TdR参入，细胞周期时相测定等方法测定细胞增殖。结果：过氧化氢（25μmol^．L^－1）和甲萘醌（0.5μmol^．L^－1）可诱导培养的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖, 使其蛋白总量增加，S期细胞比例增高，DNA合成率增加。金属硫蛋白可以抑制过氧化氢和甲萘醌诱导的血管平滑肌细胞增殖。结论：金属硫蛋白对预防由活性氧诱导的血管平滑肌细胞增殖所引起的疾病可能具有重要作用。

中国图书资料分类法分类号R332.11-332

The inhibitory effect of metallothionein on the proliferation

of vascular smooth muscle cells induced by reactive oxygen species

GE Shu-Jun^#, FENG Zhi-Hui, ZHONG Chong-Xia, TAO Jia-Ping, CHENG Shi

(#Department of Biophysics, Beijing Medical University, Beijing100083）

MeSHMetallothionein/pharmacolMuscle, smooth, vascular/growthReactive oxygen species/adv effMuscle, smooth, vascular/drug eff

ABSTRACTObjective: To investigate the effect of metallothionein on the proliferation of vascular smooth muscle cells induced by reactive oxygen species.Methods: Menadione and H₂O₂ were added to the medium of cultured rat aortic vascular smooth muscle cells as internal and extraneous reactive oxygen species respectively. Protein quantitative assay,³H-TdR incorporation and cell cycle phase analysis were used to detect proliferation of vascular smooth muscle cells.Results: The results showed that menadione（0.5 μmol^．L^－1） and H₂O₂ （25μmol^．L^－1） enhanced the proliferation of vascular smooth muscle cells with protein concentration increased, and the ratio of S phase became higher and³H-TdR incorporation increased. Metallothionein could inhibit the effects of menadione and H₂O₂ on the proliferation of vascular smooth muscle cells.Conclusion: Metallothionein may have certain effect in preventing disease caused by reactive oxygen species induced vascular smooth muscle cells proliferation.

（JBeijing Med Univ, 1999,31:512-515)

血管平滑肌细胞（ vascular smooth muscle cells, VSMC）增殖是动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）形成及经皮腔内冠状动脉成形术( percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA ) 后再狭窄的重要原因^［1］。对VSMC增殖机制以及抑制其增殖的研究近年来一直是心血管领域的热点。有证据表明，动脉血管在损伤、炎症等情况下局部产生的过量活性氧（ reactive oxygen species, ROS）对刺激VSMC增生起了重要作用^［2～6］。因此，有效地阻断活性氧对VSMC的增殖作用是控制动脉粥样硬化和预防血管成形术后再狭窄的重要途径之一。金属硫蛋白（metallothionein, MT）是含多量巯基和金属的非酶类应激蛋白，对自由基有很强的清除作用，是体内目前已知最强的^·OH清除剂^［7］。本实验室制备的锌₇-金属硫蛋白（Zn₇-MT ）不但去除了有毒金属镉，而且有更强清除自由基作用^［8，9］。据此，本实验以培养的大鼠主动脉平滑肌细胞为对象，观察Zn₇-MT对活性氧促VSMC增殖的影响，为MT在动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等血管增生性疾病上的应用提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验材料

主要试剂：DMEM、小牛血清、胰蛋白酶和RNA酶购自Gibco公司，甲萘醌（menadione，2-methyl-1,4-naphthaquinone）、碘化丙啶购自Sigma公司, 氚标胸腺嘧啶核苷（［³H］thymidine,［³H］TdR）购自中科院上海原子能所，锌₇-金属硫蛋白（Zn₇-MT）由本室制备。其它试剂均为进口分装或国产分析纯。

主要仪器：CO₂孵箱（美国Napco）, Wallac 1410液闪计数仪（Pharmacia），FACS流式细胞仪（德国Becton Dickison）

1.2大鼠胸主动脉平滑肌细胞原代培养

Wistar大鼠（由北京医科大学实验动物中心提供），体重200～250g，200g^．L^－1乌拉 坦麻醉（每千克体重5 ml），无菌条件下，取出胸主动脉，去除血管内膜及外膜，将中膜组织以贴块法进行SMC原代培养。培养液为含20%(体积分数)小牛血清（NCS）的DMEM培养液，细胞融合后，用 1.25 g^．L^－1 胰蛋白酶消化传代。光镜下观察细胞呈典型的峰-谷状表现，经肌动蛋白抗体免疫组化鉴定后，证实为VSMC。实验用4～10 代细胞。

1.3蛋白含量测定

将VSMC按1×10⁵ml^－1密度接种于24孔培养板，每孔0.5 ml。用含10%(体积分数)NCS的DMEM培养24 h后，更换不含NCS的DMEM培养24 h，使细胞同步化于G₀期。然后换成含5%(体积分数)NCS的DMEM培养液，实验组同时加入药物处理，继续培养24 h，1.25 g^．L^－1的胰蛋白酶消化细胞，2 mol^．L^－1 NaOH 溶解细胞，最后用考马斯亮蓝法测定每孔细胞总蛋白量。以此反映每孔细胞总数。

1.4流式细胞仪测定细胞周期时相

将VSMC按1×10⁵ ml^－1 接种于100 ml细胞培养瓶。每瓶4 ml。细胞培养，同步化及药物处理方法同前。加药后继续培养24 h，1.25 g^．L^－1的胰蛋白酶消化细胞，收集细胞约1×10⁶，制成单细胞悬液，将其固定于80%(体积分数)乙醇24 h以上，离心弃去固定液，PBS洗3次，加RNA酶（10 g^．L^－1）20μl，37℃ 消化30min。最后加入50g^．L^－1碘化丙啶250μl,上机测试。

1.5细胞合成DNA测定

将VSMC按每孔1×10⁵密度接种于96孔培养板，每孔0.1 ml。细胞培养，同步化及药物处理方法同前。加药后继续培养24 h，在实验结束前4～6h加入³H-TdR（3.7×10⁵ Bq^．ml^－1）每孔7.4×10³ Bq，实验结束后，PBS冲洗细胞3次，1.25g^．L^－1胰蛋白酶消化细胞，2mol^．L^－1 NaOH 溶解细胞，用多头细胞收集器将其抽滤到玻璃纤维滤膜上，晾干后将其放入液闪瓶中，加入闪烁液，避光放置过夜，用Wallac1410液体闪烁计数仪测定滤膜的放射活性（Bq）。

1.6统计学方法

实验结果以±s表示。统计学分析采用方差分析组间q检验。P＜0.01为差异具有显著性。

2实验结果

2.1过氧化氢（H₂O₂）和甲萘醌对VSMC蛋白定量的影响

分别用12.5、25、50、100、200和300 μmol^．L^－1浓度的H₂O₂作用于VSMC，结果显示12.5，25 和50μmol^．L^－1的H₂O₂使VSMC细胞蛋白总量均明显增加。且25μmol^．L^－1 H₂O₂刺激VSMC增殖作用最为明显。据此选择该浓度作为本实验刺激VSMC增殖的浓度。

分别用0.05、0.1、0.5、1、5和10 μmol^．L^－1甲萘醌作用于VSMC，结果显示在0.1和0.5μmol^．L^－1甲萘醌作用下，VSMC细胞蛋白总量均明显增加。且0.5μmol^．L^－1甲萘醌刺激VSMC增殖作用最为明显。据此选择该浓度作为本实验刺激VSMC增殖的浓度。

2.2MT对H₂O₂和甲萘醌促VSMC细胞增殖的影响

由表1可看出，H₂O₂ （25μmol^．L^－1）和甲萘醌（0.5μmol^．L^－1）可明显增加VSMC蛋白总量（P＜0.01）。Zn₇-MT(5×10^－6mol^．L^－1) 可明显抑制上述浓度H₂O₂和甲萘醌引起的VSMC蛋白总量的增加（P＜0.01）