摘要目的：观察激光心肌血管重建术(transmyocardial laser revascularization, TMR)后新生血管的变化及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor ，bFGF）在缺血心肌的表达。方法：制作大鼠急性心肌缺血模型，以单纯缺血为对照组，实验组行激光打孔。手术后6个不同时间点（3天、1周、2周、4周、6周、8周）观察新生血管的变化情况并用免疫组化方法观察VEGF及bFGF的变化，并于显微镜下行计算机图像扫描计算光密度值。结果：实验组2周时可见新生的毛细血管，随时间推移逐渐增多。实验组孔道区在术后3天即有VEGF的表达，在4周时开始上升，bFGF在4周无明显表达，二者于6周时达高峰(0.062±0.004 vs 0.198±0.022，P＜0.001；0.118±0.017 vs 0.233±0.012，P＜0.001)，8周开始下降。对照组仅于2周、4周有少量表达，于6周后逐渐消失。结论：TMR术可通过介导致血管生成的生长因子（如VEGF及bFGF）的表达来达到其部分血管新生的作用。

中国图书资料分类法分类号R542.22-332

Alteration of vascular endothelial growth factor

and basic fibroblast growth factor post transmyocardial laser revascularization

GUO Jing-Xuan^＃， HUANGXuan， ZHANGPing， GEJi

(#Department of Cardiology, the Third Hospital, Beijing Medical University, Beijing100083)

MeSHAngioplasty, laserEndothelial growth factorsFibroblast growth factor, basic/metab

ABSTRACTObjective: To observe the new vessel growth and the expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and basic fibroblast growth factor(bFGF) after transmyocardial laser revascularization(TMR) and to investigate the relationship between TMR, growth factor and angiogenesis.Methods:Preparation of acute myocardial ischemia rats， the control group is ischemia rats，the experiment group is ischemia and TMR rats. At six different time （3 days，1 week， 2 weeks，4 weeks，6 weeks，8 weeks），to observe the alteration of VEGF and bFGF by immunohistochemistry.Results: TMR group showed capillary growth beginning from week 2 and thereafter gradually increased till week 8. TMR group had significant higher VEGF expression than controls in all subgroups with a peak in week 6 postoperatively (0.062±0.004 vs 0.198±0.022， P＜0.001). No significant differences in bFGF expression were found between two groups on day 3 and in week 1. It began to increase in week 2 in controls and reduced thereafter. In TMR group, it peaked in week 6. Level of bFGF were significant higher in TMR group compared with the control group in weeks 6 and 8 (0.118±0.017 vs 0.233±0.012, P＜0.001; 0.113±0.034 vs 0.162±0.010, P＜0.001).Conclusion: The expression of VEGF and bFGF was significantly increased after TMR procedure with vascular growth beginning in week 2 in the model of acute myocardial ischemia in rats. It appears that the angiogenic response was mediated by the release of certain angiogenic growth factors such as VEGF and bFGF. As the increasing recognition that the long-term patency of myocardial channels created by laser does not exist, its mechanism may be related to the effect of angiogenesis.

（J Beijing Med Univ, 1999,31:536-539)

激光心肌血管重建术（transmyocardial laser revascularization, TMR）是近年来发展起来的改善冠心病心肌缺血的一种方法。尽管TMR在临床上已被广泛应用，但其作用机制不清。本研究利用大鼠急性心肌缺血模型，观察TMR 术后新生血管的变化及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（ basic fibroblast growth factor,bFGF）在缺血心肌的表达，探讨TMR与血管生长因子及血管新生间的关系，为进一步阐明 TMR的机制提供新线索。

1材料与方法

1.1实验动物

正常雌性Wistar大鼠84只，体重180～220g,由北京医科大学实验动物中心提供，于北京医科大学第三医院实验动物科饲养。

1.2仪器及试剂

激光仪及传输系统：调制Nd∶YAG激光仪，由中国科学院电子研究所与北京医科大学第三医院联合研制，传输系统采用裸露光导纤维，直径为400μm,采用接触式操作方式，激光波长1.06 μm，脉冲能量为1×10³J，峰值功率2×10⁴W,平均功率为25W。以脉冲形式发放。

计算机图像分析系统：LEICA QWIN,Q550IW美国。

免疫组化试剂盒（SP Kit），美国ZYMED公司生产；兔抗鼠 VEGF多克隆抗体及免抗鼠bFGF-2多克隆抗体，美国Santa Cruz 公司生产，均购自北京中山生物技术有限公司。

封闭用正常羊血清、3-3′-二氨基联苯胺(DAB)购自北京中山生物技术有限公司。

1.3动物模型的制作及分组

动物分为实验组（TMR 组）和对照组，每组各7只。随机按术后处死的不同时间（3天、1周、2周、4周、6周、8周）又分为6组。

大鼠以乙醚吸入麻醉，于左侧第4肋间隙旁或心尖搏动最强处开胸，暴露及固定心脏，于右心耳与肺动脉根部之间结扎左冠状动脉(冠脉)主干或前降支，造成急性左室前壁心肌缺血模型，实验组动物结扎后即刻于左室前外侧壁以接触式行激光打孔，每只动物打孔3个，孔距2～3 mm,呈三角形分布，术毕关胸，缝合胸壁及皮肤。对照组仅行冠脉结扎术，不行激光打孔，余同实验组。

1.4Hematoxylin and Eosin(HE)染色

动物断颈处死，心标本固定于4 g^．L^－1多聚甲醛溶液中，石蜡包埋，切片厚度为6μm。HE染色后于光学显微镜下观察新生毛细血管的变化。

1.5免疫组化染色法

石蜡切片，常规脱蜡至水后于3 g^．L^－1过氧化氢溶液中孵育，抑制内源性过氧化酶。用10g^．L^－1正常羊血清封闭10 min后，加入Ⅰ抗［VEGF1∶50（体积比);bFGF 1∶40(体积比)］,至湿盒中先于37℃温箱孵育30 min后放入4℃冰箱48 h，取出冲洗后依次加入生物素标记的Ⅱ抗（1∶20，体积比）及辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，然后行DBA显色，光镜下控制显色时间。以细胞内出现棕黄色颗粒沉着为阳性反应。染色后的切片于显微镜下行计算机图像扫描计算光密度值，每个样本扫描6个视野取其平均值作为该样本测得值，同组间比较，在同一条件下进行。

1.6统计学分析

计量资料结果以±s表示，组内比较用t检验，以P＜0.05为差异有显著性。

2结果

2.1标本大体形态所见

对照组与TMR组的左室前外侧壁、心尖上方可见到萎缩、色灰白的心肌组织，心壁变薄变硬。TMR组左室前外侧壁可见到点状白色痕迹，直径约0.5～1mm，周围未见到焦痂，TMR手术2周以后，有的心脏于打孔区产生心包粘连，切开心脏，肉眼不能见到孔道内口。

2.2HE染色观察新生血管的变化

术后3 d，实验组出现明显的炎症反应，可见大量单核细胞、淋巴细胞、成纤维细胞等炎症细胞聚集，较对照组明显，两组均未见到新生血管；术后1周，实验组孔道区仍可见炎症细胞聚集，于心外膜处可见明显扩张的血管，对照组表现同前；术后2周，实验组心外膜处可见新生的细小的毛细血管，管壁被覆一到两个内皮细胞内充一到数个红细胞，对照组仍未见到新生的毛细血管；术后4～8周，对照组表现无明显改变，而实验组可见到新生的毛细血管随时间逐渐增多。

2.3组织切片免疫组化的镜下观察

VEGF术后3天，对照组未见到免疫反应的阳性物表达，实验组的孔道区可见到大量炎性细胞聚集，心肌细胞胞浆内可见棕黄色颗粒沉着，在孔道区以外的心肌细胞内未见着色(P＜0.01)；术后1周，对照组及实验组炎症反应减弱，对照组仍未见到着色的阳性物及阳性细胞，而实验组孔道区心肌细胞内有浅淡着色(P＜0.01)；术后第2周，对照组心肌细胞胞浆内仍无明显阳性物表达，实验组的孔道区心肌细胞胞浆内着色较术后1周加深，棕黄色颗粒呈条带状分布于胞浆内(P＜0.01)；术后第4周，对照组心肌细胞胞浆内呈阳性反应，实验组孔道区及其周围正常心肌细胞内着色加深(P＜0.01)；术后第6周，对照组阳性物表达明显减少<