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中国图书资料分类法分类号R714.24
The expression and quantity study of inducible nitric oxide synthase in placenta and umbilical cord of pre-eclamptic pregnancy
SONG Ming-Qing， LIU Bin
(Department of Histology and Embryology, Beijing Medical University， Beijing100083)
MeSHGestosis, EPH/enzymolPlacenta/chemUmbilical cord/chemNitric oxide synthase☆
ABSTRACTObjective: To study the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) in placenta and umbilical cord of normotensive and pre-eclamptic pregnancy.Methods: Histology, immunohistochemistry, in situ hybridization and image analysis.Results: The expression of iNOS was increased in the syncytiotrophoblast and endothelial cells of umbilical cord vessels of pre-eclampsia women , while the expression of iNOS in vascular smooth muscle cells decreased in this group.Conclusion: The abnormal expression of iNOS in placenta and umbilical cord of pre-eclamptic pregnancy may play physiological or pathalogical role in the development of pre-eclampsia.
(J Beijing Med Univ, 1999,31:412-414)
血管舒张因子一氧化氮（nitric oxide, NO）是导致母体妊娠期心血管系统发生血容量增加、血压下降、血液重新分布等生理性改变的重要因素。胎儿-胎盘循环所产生的NO是妊娠期NO的主要来源，NO产生异常被认为是妊娠高血压综合征(妊高征)发病的重要因素之一［1］。NO在体内由一族一氧化氮合酶（nitric oxide synthase , NOS）催化生成,人们常通过对NOS的研究来推导NO的产生状况。关于胎盘循环中NOS 的表达与妊高征的研究已有报道，但均为对内皮型NOS（eNOS）的研究［2］，而对于诱生型NOS（iNOS）在胎盘、脐带中的表达及与妊高征的关系则少见报道。本研究采用免疫组化、原位杂交、图像分析等方法，对正常足月妊娠和妊高征者胎盘、脐带iNOS的表达进行了定位、定量研究，以探讨其在妊高征胎盘、脐带中的表达及其意义。
1材料与方法
1.1研究对象
正常足月妊娠孕妇23例，平均年龄(31±4)岁，平均孕(39±1)周，其中阴道分娩2例，剖宫产21例。妊高征孕妇20例，平均年龄(30±3)岁，平均孕(36±4)周，其中阴道分娩1例，剖宫产19例。妊高征诊断标准按文献［3］。
1.2取材
阴道分娩或剖宫产产妇的胎盘娩出后，立即取胎盘中段及脐带组织，固定于40 g·L－1多聚甲醛，石蜡包埋。
1.3试剂
兔抗人iNOS多克隆抗体为Santa Cruz 公司产品，免疫组化ABC试剂盒为Vector公司生产。iNOS cDNA片段由北京医科大学医病理学系基因诊断中心制备，用随机引物法标记为地高辛探针，其标记和检测药盒为德国Boehringer Mannheim公司产品。
1.4形态学观察
40 g·L－1多聚甲醛固定标本，石蜡包埋，6μm切片，HE染色，光镜观察。
1.5免疫组织化学染色
石蜡切片6 μm，脱蜡，体积分数为0.3 ％的H2O2-甲醇处理消除内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗 3次，每次2min，柠檬酸缓冲液（pH 6.0）92～98℃煮沸20 min，PBS 洗3次，每次5 min，用稀释的正常羊血清37℃ 孵育20 min，滴加兔抗人iNOS多克隆抗体1∶50(体积比），置湿盒4 ℃过夜；用ABC药盒染色，脱水，透明，封片，光镜观察iNOS在组织中的分布，出现棕黄色染色为阳性结果。以PBS代替iNOS抗体作为阴性对照。
1.6原位杂交
iNOS mRNA的检测：石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，PBS洗2次，蛋白酶K 37℃ 15 min，40 g·L－1多聚甲醛10min，PBS洗3次，每次5min，0.1mol·L－1 HCl室温10min,体积分数90％的乙醇脱水，风干，混匀地高辛标记的cDNA探针和杂交液，95℃10min加热变性，滴加切片后用封口膜覆盖，42 ℃20 h保温（湿盒中加体积分数为50％的甲酰胺），切片置5×SSC中揭去封口膜，体积分数为50％的甲酰胺/2×SSC 30 min, buffer1 洗2次 ，每次5 min,buffer2（试剂盒中的阻断剂用buffer1按1∶100体积比稀释）洗涤30 min，抗地高辛抗体（用buffer2按1∶500体积比稀释）37 ℃ 40min，buffer3 3次，每次2min，加显色液（1μl NBT, 1μl BCIP/100μl buffer3），镜检终止显色。杂交液中不加iNOS探针或加无关探针作为阴性对照。
1.7图像分析
用Leica Q500MC图像分析仪对iNOS 免疫组化及原位杂交切片染色进行定量分析，每例切片在绒毛或脐血管内皮处随机采集10个视野，以平均光密度（D）值表示着色强度。对绒毛间质Hofbauer细胞以同法采集视野，进行计数。实验结果以±s表示，用t检验作统计分析。
2结果
2.1免疫组化染色
2.1.1胎盘胎盘组织内iNOS免疫组化染色显示，正常妊娠组大部分胎盘绒毛合体滋养层细胞不着色，或仅有浅淡着色，残留的细胞滋养层细胞有着色；妊高征者的绒毛合体滋养层细胞较多呈棕黄着色。正常及妊高征胎盘绒毛间质内可见散在的深棕黄色着色的Hofbauer细胞（图1、2）。正常妊娠组胎盘的绒毛干大血管及绒毛小血管平滑肌细胞多着色，内皮细胞扁平，着色少；而妊高征组胎盘的一些绒毛干大血管及绒毛小血管平滑肌细胞着色明显减弱或无，内皮细胞着色增强（图3、4）。
图1免疫组化：正常妊娠胎盘，绒毛合体滋养层细胞iNOS 染色几乎 无着色。ABC 法 ×100
Figure 1Immunohistochemistry: Normotensive placenta, the iNOS staining is almost no staining in syncytiotrophoblast . ABC ×100
图2免疫组化：妊高征胎盘，绒毛合体滋养层细胞iNOS染色呈棕黄色颗粒。ABC 法 ×100
Figure 2Immunohistochemistry: Preeclampsia placenta, the iNOS staining is stronger in syncytiotrophoblast. ABC ×100
图3免疫组化： 正常妊娠胎盘，绒毛干血管平滑肌细胞着色明显，内皮细胞几乎无着色。ABC 法 ×100
Figure 3Immunohistochemistry: Normotensive placenta ,the iNOS staining is stronger in vascular smooth muscle cells of sterm villi and there is very weakly iNOS staining in endothelial cells . ABC ×100
图4免疫组化：妊高征胎盘，绒毛干血管平滑肌细胞无着色，内皮细胞明显着色。ABC 法 ×100
Figure 4Immunohistochemistry: Preeclampsia placenta, the iNOS staining is stronger in endothelial cells and no staning in vascular smooth muscle cells of sterm villi. ABC ×100
2.1.2脐带正常妊娠组脐动脉、脐静脉平滑肌细胞多有着色，内皮细胞扁平，着色较少；而妊高征组脐静脉或部分脐动脉内皮细胞着色增强（图5、6）。
