摘要目的：研究胰岛素毫微球(insulin-loaded nanoparticles, INS-NP)经大鼠肺部给药后的降血糖作用。方法：建立大鼠肺部给药的动物模型，通过葡萄糖氧化酶法测定血糖质量浓度来评价INS-NP 经肺部给药后对大鼠的降血糖作用。结果：大鼠肺部分别给与5、10、20 u·kg^－1的INS-NP，以血糖下降至给药前的70%以下所持续的时间(duration below 70% level, DBL_70%)为考察指标，5u·kg^－1的INS-NP的DBL_70%与其对照溶液相近，而10、20 u·kg^－1的INS-NP 的DBL_70%均明显大于各自的对照溶液。INS-NP肺部给药的相对药理生物利用度达到59.2%。结论：与胰岛素溶液相比，INS-NP经大鼠肺部给药后能显著延长其血糖下降的时间。

中国图书资料分类法分类号R977.15

Hypoglycemic effects of insulin-loaded nanoparticles by

pulmonary delivery to normal rats

SHEN Zan-Cong^#，ZHANG Qiang，WEI Shu-Li

(# Department of Pharmaceutics，Beijing Medical University，Beijing100083)

MeSHInsulin/adminMicrospheresBlood glucose/drug effDrug administration, respiratory routes

ABSTRACTObjective：To investigate the hypoglycemic effects of insulin-loaded nanoparticles (INS-NP) after pulmonary delivery to rats.Methods：The pulmonary delivery model was established in normal rats. Blood glucose levels were measured using glucose oxidase method (GOD) to evaluate the hypoglycemic effects .Results：After 5， 10， and 20 u·kg^－1 of INS-NP were administered from the lung，The duration below 70% level (DBL_70%) of 5 u·kg^－1 INS-NP was approximately the same as that of its control solution，while 10 u·kg^－1 and 20 u·kg^－1 INS-NP had greater DBL_70% values than their control (INS-SOL) .The relative pharmacological bioavailability of INS-NP reached 59.2%.Conclusion： Pulmonary delivery of INS-NP to rats can significantly prolong the duration of hypoglycemic effect.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:436-438)

目前，胰岛素(Insulin，INS)的非注射给药途径的研究引起人们的广泛关注，由于口服给药研究没有重大的突破，肺部给药途径已经成为人们研究的新焦点^［1］。肺部具有吸收表面积大，肽类水解酶活性低，药物容易穿透等特点，为INS等蛋白多肽药物的吸收提供了良好的生理环境。目前国外INS肺部给药制剂研究已进入了临床试验阶段，如INS的气雾剂、喷雾剂、及粉末吸入剂等^［2～4］，本文尝试以氰基丙烯酸正丁酯毫微球为载体，以血糖为考察指标，研究INS毫微球(insulin-nanoparticles，INS-NP)经大鼠肺部给药后的降血糖作用，为以后开发INS肺部给药制剂打下基础。此项研究国内外尚未见报道。

1材料与方法

1.1材料与仪器

INS(徐州生化制药有限公司，26.3 u·mg^－1)；氰基丙烯酸正丁酯(BCA)购自西安化工研究所；戊巴比妥钠购自中国医药公司北京采购供应站；乙腈为色谱纯，INS-NP样品根据文献［5］方法制备，浓度分别为10、20、40 u·ml^－1，其它试剂均为分析纯。

美国Beckman 公司超速离心机；美国Brookhaven Instruments 公司粒度分析仪；美国AST公司高效液相色谱仪，紫外检测器；大连伊利特公司C₁₈反相柱(250 mm×4.6 mm内径，5 μm)。

SD大鼠由本校实验动物中心提供。

1.2实验方法

INS-NP的粒度测定：取INS-NP样品适量，用水稀释后在粒度分析仪上进行测定，经动态光散射处理软件处理，记录并打印测定结果。

INS-NP包封率的测定：采用反相高效液相色谱法，流动相为乙腈∶磷酸缓冲液(pH 3.0)体积比为73∶27，检测波长为276 nm，流速1.0 ml·min^－1。INS-NP经超速离心35000 r·min^－1 30 min后，取上清液及反应前的INS总液各25 μl进样，从两者在色谱图上的峰高求出未包封的INS的量X_f和INS的总量X_t，以下式计算INS-NP的包封率：

包封率＝(X_t－X_f)/X_t×100%

血糖值测定：采用葡萄糖氧化酶法。酶试剂的配制及标准曲线的建立按文献［6］方法进行。标准曲线方程为：A＝0.3X＋0.0023 (r=0.9999)，其中X为血糖水平(g·L^－1)，A为505 nm处吸收度测定值。测定时待血样凝固后离心(3000 r·min^－1，15 min)，精密吸取血清20 μl，加酶试剂2.0 ml，按标准曲线制作方法操作，用上述标准曲线计算血糖值。经测定葡萄糖在血清中的高、中、低3种质量浓度的平均回收率分别为101.8%±2.4%，101.2%±0.9%，95.8%±2.2%(n=5)。

INS-NP肺部给药降血糖实验：雄性SD大鼠，体重(250±50) g，随机分组，每组5～6只，实验前禁食12 h。动物经腹腔注射戊巴比妥钠40 mg·kg^－1进行麻醉，麻醉后将动物仰卧固定，手术暴露出气管，往气管内每200 g体重注入药液100 μl，给药时使动物与水平成90°并维持30 s后，再与水平成30°放置。动物能自主呼吸。按上法分别给动物不同浓度的INS-NP及INS-SOL，另皮下注射5 u·kg^－1 INS-SOL作对照，以求算INS-NP的相对药理生物利用度。在不同时间间隔于大鼠尾尖取血0.2 ml，离心取血清20 μl ，按前法测定血糖值。

2结果

INS-NP的平均粒径为254.7 nm，粒径的多分散性为0.064。INS-NP的平均包封率为79.1%±0.20% (n=3)。

正常大鼠肺部给药5、10、20 u·kg^－1的INS-SOL和INS-NP，与空白对照相比，均表现出明显的降血糖作用(表1、2)。 以血糖降低至给药前的70%所持续的时间(duration below 70% level , DBL_70%)为考察指标，5、10、20 u·kg^－1的INS-NP的DBL_70%分别为6.7 h，12.7 h，18.1 h；而相应剂量的INS-SOL的DBL_70%分别为6.5、6.7、10.6 h。5 u·kg^－1的INS-NP的DBL_70%与其对照的INS-SOL相近，而10、20 u·kg^－1 INS-NP的DBL_70%分别比各自对照溶液大6.0 h和7.5 h，随着剂量的增加，INS-NP的长效作用更加显著。

表1不同剂量的INS-SOL经大鼠肺部给药后对血糖变化的影响(％，±s)

Table 1Blood glucose level changes after pulmonary delivery of different doses of INS-SOL to normal rats (％，±s)

t/h Control 5 u·kg^－1 10 u·kg^－1 20 u·kg^－1 0 100.0 100.0 100.0 100.0 1 98.7±5.7 70±9 69±7^** 66.2±4.7^** 2 96.2±3.5 45±9^*** 41±9^** 23.8±4.6^*** 4 99.6±2.1 22±8^*** 20±9^** 6.7±2.2^*** 6 93.3±4.2 39±17^** 40±8^** 4.3±1.6^*** 8 82.6±6.5 80±8 74±11 20.2±13.8^*** 12 72.3±9.3 / / 74.4±9.2

n=5-6；control， PBS (pH=7.0) without insulin；* P＜0.05,

** P＜0.01, *** P＜0.001， vs control．

表2不同剂量的INS-NP经大鼠肺部给药后对血糖变化的影响(%, ±s)

Table 2Blood glucose level changes after pulmonary delivery of different doses of INS-NP to normal rats (%, ±s)

t/h Control 5 u·kg^－1 10 u·kg^－1 20 u·kg^－1 0