多柔比星（doxorubicin，adriamycin）为蒽环类抗生素，结构类似柔红霉素，属抗肿瘤药。文献［1～4］报道了许多高效液相色谱法，这些方法主要用于测定盐酸多柔比星的含量和主要代谢物。在试图重现这些方法时，我们遇到了一些困难，主要表现在(1)难以重现或重现不稳定；(2)方法复杂、繁琐；(3)组织提取物中有大量不溶物；(4)回收率差；(5)盐酸多柔比星保留时间太短，与内源性物质分不开。为此，本文旨在建立简便可行的方法，用于定量动物体内组织中多柔比星的质量分数。

1材料与方法

1.1材料与试剂

仪器：高效液相色谱仪(TSP, 美国)，Spectra100可变波长紫外检测器(TSP, 美国)，YWG-C18不锈钢色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 大连依利特)，WDL-95色谱工作站(中科院大连化学物理研究所)；组织匀浆器，离心机(北京医疗仪器厂)；工业用气态氮(北京)，手术器械若干。

试剂与药品：乙腈(色谱级，天津)；磷酸、氯仿、甲醇等(均为市售分析纯试剂)。盐酸多柔比星隐形脂质体、普通脂质体(均为本室研制)，盐酸多柔比星注射剂（自制）。

动物：昆明种小鼠，雌雄兼用，体重(20±2) g。

1.2样品采集和预处理

空白样品采集：将小鼠数只分别断头处死，收集空白血液，取出心、肝、脾、肺、肾用生理盐水漂洗去血液，滤纸吸干，精密称重后置1.5 ml尖底具塞试管于－20℃冰箱保存。

样品采集：将盐酸多柔比星注射液、盐酸多柔比星普通脂质体注射液、盐酸多柔比星隐形脂质体注射液分别用生理盐水注射液稀释至0.5g·L^－1，尾静脉注射，给药剂量为5mg·kg^－1。每30只小鼠随机分为5组，每组6只，分别于给药后1、3、5、24、48h将小鼠断头取血，随后取出心、肝、脾、肺、肾脏，用生理盐水漂后用滤纸吸干，精密称重后置1.5ml尖底具塞试管中，于－20 ℃冰箱保存。

预处理：取各时间点样品置匀浆器中，加入0.8 ml枸橼酸缓冲液(pH 6.8)，匀浆1 min (3 000 r·min^－1)，转移至离心管中，加入氯仿-甲醇(体积比为4∶1)，旋涡振摇1min，离心，精密吸取氯仿层3.0ml，60 ℃下N₂吹干，用封口膜封口待测。加入甲醇200μl溶解残渣，精密吸取50μl注入HPLC六通阀。

1.3色谱条件

流动相为乙腈-水(体积比为32∶68, 用8.67 mol·L^－1磷酸调pH至3.0), 流速为1.5 ml·min^－1,检测波长为254nm，灵敏度为0.01～0.005。

工作曲线：精密称取减压干燥的盐酸多柔比星适量，定量溶解成100.0 mg·L^－1标准贮备液，置4 ℃冰箱备用。取标准贮备液稀释成系列标准液，分别取系列标准液加入至心、肝、脾、肺、肾及血液组织空白匀浆中，制备成系列浓度的含药组织样品匀浆，转移至离心管中，以下照预处理内容进行。

回收率及精密度:取贮备液分别稀释成高、中、低3种浓度的标准液，参照工作曲线项下方法进行回收率及日内差和日间差测定。

2结果

盐酸多柔比星在小鼠体内各组织中的平均标准曲线、回收率、精密度及质量分数分别见表1～3。

表1盐酸多柔比星在小鼠体内各组织中的平均标准曲线

Table 1Mean calibration curve of doxorubicin hydrochloride

(DOX) in the mouse tissues

Tissue Calibrtion curve of DOX r Heart A＝1.723＋5.657C 0.9975 Liver A＝－0.816＋1.570C 0.9997 Spleen A＝－3.556＋11.321C 0.9966 Lung A＝－2.017＋11.278C 0.9989 Kidney A＝－1.118＋17.783C 0.9966 Blood A＝－0.332＋1.469C 0.9995

n＝3.

表2盐酸多柔比星在小鼠体内各组织中的平均回收率及精密度(±s)

Table 2Mean recovery and precision of DOX in mouse tissues(±s)

10^－6ω_DOX Within-day-run/% Between-day-run/% Recovery RSD Recovery RSD Heart 0.5 89.1±3.7 4.15 91.7±8.0 8.75 5.0 94.9±2.5 2.59 98.0±3.5 3.61 10.0 101.2±2.2 2.16 100.7±4.1 4.04 Liver 1.7 93.4±5.5 5.93 92.9±7.5 8.09 4.25 94.4±1.3 1.41 94.8±5.5 5.78 8.5 96.6±2.1 2.18 97.9±5.9 6.02 Spleen 1.0 90.7±0.7 0.78 91.1±2.2 2.41 5.0 96.2±3.5 3.61 95.1±5.0 5.20 15.0 97.2±3.8 3.95 96.7±5.8 5.96 Lung 1.0 95.0±3.9 4.15 94.8±6.2 6.53 2.5 95.5±4.1 4.28 97.9±5.9 5.99 10.0 99.5±1.2 1.25 96.0±4.3 4.45 Kidney 1.2 98.7±4.5 4.53 97.7±5.5 5.65 6.0 97.8±3.7 3.82 98.0±5.9 6.03 12.0 96.3±3.7 3.79 94.9±6.2 6.48 Blood 2.0 96.5±4.8 4.95 94.1±5.5 5.89 10.0 101.5±1.9 1.91 98.8±4.2 4.24 20.0 96.4±2.1 2.20 96.2±1.2 1.22

n＝3；RSD，relative standard deviation.

表3盐酸多柔比星隐形脂质体和对照制剂经尾静泳注射后在小鼠体内各组织中的平均质量分数

Table 3Mean mass fraction in the mouse tissues following tail intravenous injection of DOX, DOX stealth liposomes, regular liposomes

(10^－6ω_DOX)

1.0 h 3.0 h 5.0 h 24.0 h 48.0 h Heart Stealth¹ 3.21 3.65 2.91 2.45 1.77 Regular² 4.59 3.82 3.83 2.98 1.97 Dox³ 11.92 14.16 8.25 3.95 2.11 Liver Stealth 5.65 5.63 6.57 2.13 2.82 Regular 6.00 8.58 6.70 3.97 1.82 Dox 4.47 2.05 4.63 2.96 1.49 Spleen stealth 4.81 7.73 8.56 7.86 8.73 Regular 12.80 10.71 10.43 8.80 9.43 Do