摘要目的: 建立血浆总同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)的检测方法，测定正常人和冠状动脉硬化及先天性心脏病核心家庭血浆同型半胱氨酸水平的变化。方法：应用柱前衍生化-HPLC方法, 测定了49例正常人，74例冠状动脉硬化患者及7个先天性心脏病核心家庭中的19个成员的血浆总Hcy水平。结果: 衍生化-HPLC测定血浆总Hcy浓度的方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好的特点。正常成年血浆总Hcy浓度为(8.4±0.8) μmol·L^－1 (n=42, ±s_,下同)；冠状动脉硬化和出生性缺陷家庭成员平均血浆总Hcy水平分别为（16.9±1.7）及（28.4±1.2） μmol·L^－1，与正常人比较差异具有显著性 (P＜0.05， P＜0.001)。结论：高同型半胱氨酸是动脉硬化和先天性心脏病的一个危险因素。测定血浆Hcy可作为动脉硬化和先天性心脏病的一个辅助诊断指标。

中国图书资料分类分类法R449

Homocysteine measurement and its clinical significances

MENG Zhao-Heng^#, HAO Ling, JIANG Ning, ZHU Rong, LI Zhu, TANG Jian

(# Laboratory for Reproductive Health Research, Beijing Medical University, Beijing100083)

MeSHCysteine/bloodCoronary arteriosclerosis/diagAbnormalities/diagBirth defect^☆

ABSTRACTObjective: Homocysteine has been identified as an independent risk factor for atherosclerosis(As) and birth defective disease. Objective: To establish a method for determining total plasma homocysteine (Hcy), to inspect the changes of Hcy level for healthy individuals, pateints with coronary atherosclerosis, and kernel families with congenital heart disease(CHD).Methods: Using the method of precolumn derivatization-HPLC were measured the total plasma Hcy for 49 healthy individuals, 74 patients with coronary atherosclerosis (CAs), and 7 families having a child with congenital heart disease (n=19).Results: The method is sensitive (detection limit 0.125μmol·L^－1), specific, and has a high reproducibility (CV＜2.86%). Its recovery is 101.89%.In the groups of healthy individuals, the mean level of plasma Hcy were significantly higher in men than that in women and children, which were （9.2±1.0） (±s_, the same below); （5.8±0.6）, and （5.9±0.4） μmol·L^－1 respectively (P＜0.05). In the pateines with CAs and the kernel families with CHD the Hcy level were （16.9±1.7） and （28.4±1.2） μmol·L^－1 separately, which were significantly higher than the control (P＜0.001).Conclusion: homocysteine is a risk factor for As and CHD. the total level of plasma homocysteine may be a subsidiary indicator for the diagnosis of atherosclerosis and congenital heart disease.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:391-394)

同型半胱氨酸是一种含硫的氨基酸，它是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的一个重要中间产物。早在60年代末，已有学者注意到遗传性高胱氨酸尿症的病人多数同时伴有亚临床期心血管病。Wilcken等^［1］通过流行病学调查最先提出同型半胱氨酸是心血管病的一个独立的危险因素。近年的研究进一步证明，高同型半胱氨酸血症不仅是动脉硬化的一个新的独立的危险因素，亦是出生性缺陷的一个危险因子^［2，3］。因此，测定血浆总同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)对心血管病和出生性缺陷的诊断、预防和治疗具有重要的意义。但是，目前国内尚很少见报告。本工作应用NaBH4 将含硫氨基酸还原成硫氢基的化合物使其衍生化，再标记以荧光物质monobromobimane，最后进行反相高压色谱分析测定同型半胱氨酸^［4，5］，该方法灵敏、特异、重复性好。并测定了正常人、冠状动脉硬化患者和先天性心脏病患儿及父母血浆Hcy的变化。

1材料及方法

1.1材料

标准品L-同型胱氨酸和L-胱氨酸，N-乙基吗啡啉、二硫苏糖醇(dithioerythritol, DTE)、DMSO、正辛醇 (1-octanol)、monobromobimane购于美国Sigma Chemical Co.,硝酸铵、甲酸铵、冰醋酸、乙腈等均为市售试剂。

高压液相分析仪是Shimadzu LC-4A (岛津,日本)。 荧光检测器型号为 FL-3000 (Thermo Separation，美国) 激发波长366 nm, 发射波长476 nm。HPLC反相分析柱为 ODS-3，150 mm×4.6 mm, 5 μm颗粒 (GL Sciences Inc.,日本)。预柱2.5 mm×4.6 mm，购自北京潮声技术公司。

1.2方法

1.2.1研究对象

包括正常人、冠状动脉硬化和先天性心脏病核心家庭成员共142例，分为3组。

正常对照组：49例，其中成年人42例(男性24例女性18例)，年龄为26～70岁，均无冠状动脉狭窄及动脉硬化表现，亦无出生性缺陷及先天性心脏病生育史，临床生化，胸部X线和腹部B超检查，肺、肾、肝功能均未发现异常。其中19例(33～70岁)经冠状动脉造影检查除外冠状动脉硬化。另外有7例正常婴幼儿，年龄6～20个月。

冠状动脉硬化组：74例，其中男性59例，女性15例，年龄38～72岁，均进行冠状动脉造影确诊至少有一支冠状动脉狭窄，其程度达70%以上，而肺、肝、肾功能，血脂，心电图，胸部X线和腹部B超检查均未见明显病变，诊为冠状动脉硬化(coronary atherosclerosis, CAs)者。

先天性心脏病组：7个先天性心脏病(congenital heart disease, CHD)核心家庭共19例。其中患儿6例，年龄6个月～1岁6个月，室间隔缺损5例，法洛四联症1例；13例双亲，其中父亲6例，母亲7例，年龄26～36岁，其中患室间隔缺损3例。其余经体检、心电图、胸部X线及B超检查未发现异常。

1.2.2样品收集及贮存清晨空腹，用Vacutainer管(becton dickinson, rutherford, NJ)取静脉血，EDTA抗凝，立即离心(3000 r·min^－1,40℃，5 min)，分离血浆，贮存在－20℃备用。

1.2.3样品衍生化30 μl 测定样品, 30 μl 4 mol·L^－1 NaBH₄/0.066 mol·L^－1 NaOH/333 ml·L^－1 DMSO, 10 μl 1.65 mmol·L^－1 DTE/2 mmol·L^－1 EDTA, 10 μl 1-octanol, 20 μl 1.8 mol·L^－1 HCl，反应3 min后，加入100 μl 1.5 mol·L^－1N-乙基吗啡啉, 400 μl H₂O 和 20 μl 25 mmol·L^－1 monobromobimane/乙腈进行荧光标记, 混合后放置3 min，再加冰醋酸 40 μl终止反应，用0.45 μm 玻璃纤维膜滤过，立即进行色谱分析。

标准液：50 μmol·L^－1 L-同型胱氨酸, 600 μmol·L^－1胱氨酸溶于100 μmol·L^－1 DTE 的0.1 mol·L^－1 HCl 中，作为原液分装贮存于－20℃。应用时将原液稀释成不同浓度，同样进行衍生化。

以上试剂除盐酸、乙基吗啡啉缓冲液和水放在室温，样品及其他试剂均置于冰浴中。

1.2.4色谱分析取上述衍生化的样品20 μl 注入 150 mm×4.5 mm ODS-3 柱中。于进样前将分析柱用 30 mmol·L^－1硝酸铵和 40 mmol·L^－1甲酸铵缓冲液 ( pH 3.65 )平衡，进样后以5.0%～11.0%(体积分数)乙腈进行梯度流洗，流速 2.0 ml·min^－1。共洗脱20 min，以366 nm 和476 nm荧光波长检测其密度。

2结果

2.1特异性测定

取50 μmol·L^－1 L-同型胱氨酸和20 μmol·L^－1 L-胱氨酸 各15 μl 进行衍生化及色谱分析，结果见图1。L-胱氨酸和L-同型胱氨酸的保留时间分别为8.0及10.5 min。

1，cysteine;2,homocysteine

图1同型半胱氨酸的特异性

Figure 1Specificity of homocysteine

2.2标准曲线

分别以0、0.25、0.5、1、2.5、5.0、12.5、25.0、50.0 μmol·L^－1的标准Hcy进行HPLC测定，作标准曲线，结果见图2。由图2可以看出Hcy浓度在0.25～50 μmol·L^－1