摘要目的：进一步明确维生素D和维生素K与肾结石的关系。方法：健康成年雄性SD大鼠36只随机分成6组，即对照组、单纯成石组、维生素D组、诱石剂+维生素D组、维生素K组和诱石剂+维生素K组，测定肾脏骨桥蛋白(osteopontin, OPN) mRNA的表达量和尿晶体成分的浓度。结果：维生素D和维生素K均可促进肾脏表达OPN mRNA；维生素D可升高尿钙，维生素K则抑制尿草酸的分泌，诱石剂有降低尿镁和柠檬酸的作用。结论：维生素D过多可促进肾结石形成，而维生素K有抑制结石形成的作用。

中国图书资料分类法分类号R692.4

Effects of vitamin D₃ and vitamin K₃ on the expression

of osteopontin mRNA in rat kidney of stone model

CHANG Lian-Sheng^＃, FENG Tao, JIANG Chang-Lin， JIANG Xue-Jun,

DOU Chang-Qi, HUANG You-Yuan， GUO Ying-Lu

（＃Institute of Urology, the First Hospital, Beijing Medical University， Beijing100034）

MeSHVitamin D/pharmacolVitamin K/pharmacolOsteopontin^☆RNA, messenger/metabKidney calculi/metab

ABSTRACTObjective： To clarify the relationship between kidney calculi and vitamin D₃ as well as vitamin K₃ further.Methods： 36 adult male SD rats were randomized into control group， stone-forming group, vitamin D₃ group，vitamin D₃ with stone-forming group, vitamin K₃ group and vitamin K₃ with stone-forming group. The urine was collected on day 7, and osteopontin(OPN) mRNA of kidneys and the concentration of the crystal components in urine were detected.Results： Vitamin D₃ and vitamin K₃ could enhance the expression of OPN mRNA in rat kidneys of stone model. Vitamin D₃ could increase the excretion of oxalate in urine, while vitamin K₃ inhibited the excretion of oxalate. Stone-inducing agents could inhibit the excretion of magnesium and citrate in urine.Conclusion： The results indicate that vitamin D₃ may promote stone formation, whereas vitamin K₃ may inhibit this process.

(J Beijing Med Univ, 1999,31:429-431)

维生素D和维生素K是维持人体正常生命活动的重要因素，并与肾结石的形成有着不同程度的联系。骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是重要的尿大分子抑制物，我们测定了大鼠应用这两种维生素后肾脏 OPN mRNA 的表达量和尿晶体成分的变化 ，旨在进一步明确它们与肾结石的关系，探讨成石机制。

1材料与方法

1.1动物及分组

实验动物由北京医科大学实验动物中心提供。取健康成年雄性SD大鼠36只，体重200～250 g，随机分成6组,每组6只。

1.2方法

适应实验环境7 d后开始实验。诱石剂为含10 g·L^－1乙二醇和10g·L^－1氯化铵的自来水。第1组（对照组）：普通饲料+自来水；第2组（单纯成石组）：普通饲料+诱石剂；第3组：普通饲料+自来水+维生素D₃（皮下注射，每只大鼠10 000 U/d，连续用药1周）；第4组：普通饲料+诱石剂+维生素D₃；第5组：普通饲料+自来水+维生素K₃（皮下注射，每只大鼠4mg/d，连续用药1周）；第6组：普通饲料+诱石剂+维生素K₃；于实验第7天用代谢笼收集第1组、2组、4组和6组24 h尿，－20℃保存。然后断颈处死，取出肾脏立即置液氮中，用Northern Blot方法测定鼠肾OPN mRNA的表达，异硫氰酸胍法快速提取RNA, 12 g·L^－1甲醛变性琼脂糖凝胶电泳, 每泳道上样45μg, 虹吸转膜24 h, 80 ℃烤膜2 h, BamH Ⅰ酶切含大鼠OPN cDNA片段的质粒p2B7(美国华盛顿大学医学院Kleinman博士惠赠), 随机引物法合成³²P标记的cDNA探针, 42 ℃杂交36 h, 洗膜, －70℃条件下放射自显影24h。

1.3观察指标

用Molecular Analyst软件对Northern Blot结果进行图像分析, 测条带的灰度值。EDTA滴定法测尿钙和尿镁，光电比色法（721分光光度计）测定尿磷、草酸、尿酸和柠檬酸。偏光显微镜观察鼠肾成石情况。

1.4统计学分析

统计分析采用Graph PAD软件包进行t检验。

2结果

2.1Northern Blot结果（图1）

图1维生素D₃、维生素K₃及诱石剂对鼠肾OPN mRNA表达的影响

Figure 1Effects of vitamin D₃, vitamin K₃ and stone-inducing agent on expression of rat kidney OPN mRNA

与正常对照相比，大鼠应用维生素D₃后可使鼠肾OPN mRNA表达量升高7倍(70.5/9.3)；与单独应用诱石剂的效果接近(64.9/9.3)；维生素K₃可使鼠肾OPN mRNA表达量升高4倍(39.5/9.3)；诱石剂与维生素D₃合用使鼠肾OPN mRNA表达量升高10倍（99.9/9.3）；诱石剂与维生素K₃合用对鼠肾OPN mRNA表达量升高13倍(120.4/9.3)。

2.2尿晶体成分的变化（表1）

表1大鼠结石模型尿晶体成分的变化(c/mmol·L^－1, ±s)

Table 1Changes of crystal components of rat urine

Groups Calcium Magnesium Phosphorus Oxalate

(μmol·L^－1) Citrate Urate Group 1 1.84±1.98 2.89±1.26 33.04±7.64 0.90±0.21 12.89±5.86 1.33±0.41 Group 2 2.67±0.38 0.51±0.45^△ 36.46±6.88 3.01±0.80^△ 2.85±0.78^△ 1.52±0.46 Group 4 7.15±3.56^△* 0.77±0.45^△ 37.23±6.61 3.46±0.87^△ 5.10±3.62^△ 2.26±0.32^△* Group 6 2.74±0.35 0.69±0.54^△ 30.25±5.62 1.11±0.28^* 3.99±0.50^△ 1.71±0.46

Group 1, control group; Group 2, stone-forming group; Group 4, vitamin D₃ with stone-forming group; Group 6, vitaminK₃ with stone-forming group.△P＜0.05 vs group 1；^*P＜0.05 vs group 2．大鼠应用诱石剂后尿草酸排泄增加，尿镁和柠檬酸浓度降低，诱石剂+维生素D₃组尿钙显著高于单纯成石组，诱石剂+维生素K₃组尿草酸盐浓度明显低于单纯成石组（P＜0.05）。

2.3偏光显微镜

观察对照组鼠肾切面未见晶体沉积，单纯成石组和诱石剂＋维生素D₃组鼠肾均可见大量晶体，以后者更明显；诱石剂＋维生素K₃组大鼠肾脏仅有散在晶体分布(1～3个/高倍视野)。

3讨论

尿液晶体成分经常处于过饱和状态，正常人之所以不产生肾结石，是因为尿中还存在着阻止晶体生长和聚集的抑制物，低分子的抑制物包括焦磷酸盐、镁和柠檬酸，大分子抑制物主要是葡胺聚糖、TH蛋白、肾钙素、尿凝血酶原片段-1、间-α-胰蛋白酶抑制因子及OPN。OPN是一种磷酸化糖蛋白，由亨利氏襻、近曲小管和肾乳头表面上皮分泌，相对分子质量约51 500。正常人尿OPN浓度为～6×10^－8mol·L^－1，足以抑制草酸钙结晶，其在尿中的浓度在一定程度上反映了尿抑制结石形成的能力^［1～3］。

维生素D与尿石症的关系： 维生素D的生理功能包括促进小肠上皮和肾小管上皮细胞吸收钙、磷，促进骨钙释放，从而升高血钙。维生素D对正常生物矿化有非常重要的意义，长期应用维生素D或内源性维生素D分泌过多可发生高血钙和高钙尿，促使肾钙化和肾结石的形成^［1，2］。本次实验结果显示，诱石剂能提高尿草酸浓度，降低尿镁和柠檬酸的分泌量；大剂量维生素D虽然可使大鼠结石模型<